第八节 已知基因克隆1.pptVIP

第八章 已知序列基因的克隆 二、目的DNA片段的克隆 （一）目的DNA片段与载体的连接 1、连接酶 2、连接方式 全同源粘端：外源DNA片段两端与载体DNA片段两端具有完全相同的同源互补末端，他们之间的连接称为全同源粘端连接。 定向克隆：外源DNA片段定向插入到载体分子中的一种连接方式。 （二）重组DNA分子转入宿主细胞的方式(转） 在体外组装的DNA重组分子只有转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。 转入方式随载体的不同而不同，转移技术包括：转化、转染、显微注射及脂质体介导转移等。 1、转化（transformation）和转染（transfection） （1）化学法转化原理：低温下CaCl2处理细菌处于感受态，DNA分子形成羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，42℃短时间热处理，细胞吸收DNA复合物。 转化效率：105～106个转化子／ugDNA（CaCl2法）。 应用：可满足一般的基因克隆试验。 一、针对遗传表型的变化筛选 1、按载体的性状变化进行筛选 2、根据插入基因的遗传性状进行筛选 2、根据插入基因的遗传性状进行筛选 已知克隆基因所编码蛋白的功能，且蛋白为细菌的生命活动所必需时，可用该法筛选。 如：Leu缺陷型，培养基中加Leu 如果克隆基因是合成Leu的基因时，可以用不加Leu的培养基筛选。 二、根据重组子的结构特征筛选 1）快速裂解菌落鉴定分子大小 重组子的分子量较大（适用于插入片段较大的重组子） 2）内切酶图谱鉴定 重组子与非重组子的内切酶图谱不同 3）PCR筛选重组子 利用插入片段两端的特异引物，进行PCR，能扩增出特异片段的转化子为重组子。 小结 目的基因获得的方式及各自的优缺点； 重组质粒转入宿主细胞的方式及各自的原理； 重组子筛选的方法及原理（主要是针对遗传表型变化和重组子结构特征）。 * * 基因克隆的一般步骤：分、切、接、转、增、筛（检） 获得外源DNA片段（分） 外源DNA片段与载体连接（切、接） 重组DNA分子转入宿主细胞（转） 重组细胞扩增（增） 重组子的筛选与鉴定（筛） 目的基因的确认与分析 一、外源DNA片段的获得（分）（一）化学法合成 1、优点：准确性高； 2、缺点：成本高、 速度慢、长度短（100 bases） 3、应用：一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、接 头、较小的基因等。 4,4’-二甲氧基三苯甲基 基 本 原 理 （二）生物化学法 根据目的序列设计引物，从含有目的序列的组织、细胞中提取基因组DNA或RNA，然后以目的DNA为模板，利用PCR方法合成特异的DNA片段。 1、优点：效率高、速度快、特异性好、长度达 几十kb。 2、缺点：需要模板DNA，有10-4~10-3的错配率。 3、应用：可用于已知序列的几乎所有DNA片段 的克隆。 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 转化（transformation）：质粒DNA分子导入细菌的过程； 转染（transfection）：指以噬菌体、病毒载体构建的重组子导入细胞的过程。 本质上讲，两者没有根本的差别。 可分为化学法和电击法。 （2）电击法转化（electroporation） 原理：电脉冲使宿主表面形成暂时性的微孔。 特点： a．操作简单 b．转化率极高109～1010转化子／ugDNA c．任何菌株均适用 应用：可用于文库的构建及其它要求极高的转化。 2、转染（transfection） 指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。 原理：将重组DNA分子体外包装成噬菌体颗粒，按一定比例与宿主细胞混合培养，利用噬菌体的主动感染，将重组DNA分子注入宿主细胞。 特点： 1）转入效率高107 pfu／ug DNA； 2）外源DNA可整合入宿主细胞染色体中处溶源状态； 3）虽不需制备感受态细胞和热休克处理，但其转染效率常受多种因素影响，且克隆的保存也较复杂。 应用：常用于文库的构建。 三、重组子的筛选与鉴定 （筛） 1、按载体的性状进行筛选 1）抗性转入获得（多用于筛选转化子） 2）抗性插入失活：指外源DNA片段插入载体的抗性基因中，致该基因无法正常表达有活性的抗性蛋白。 3）蓝白斑筛选（?一互补） 载体：LacZ的调控序列和N端146个氨基酸残基的编码序列（?肽） 宿主菌：染色体DNA含有LacZ的缺失部分肽段的编码序