WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究论文.docVIP

　　WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究论文 胡绍燕， 陈子兴， 赵晔， 岑建农， 谷敏， 傅铮铮， 何军， 顾伟英 【摘要】 本研究探讨CF7, T47D and 293) and MC7721, HT29 and SHG44). The mean fluorescence intensity (MFI) of EGFP representing the transcriptional activities of promoter and/or enhancer etry in the transfected cells oter and pECF7 and SHG44 (9.46±1.10 and 7.29±0.73 times of pEGFP1 level),.freeles as much as pEGFP1) respectively. Among hematopoietic cell lines, EGFP expression es of pEGFP1), es of pEGFP1 level) respectively. pEBI公司产品；AflⅡ和StuⅠ为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品；小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）为Promega公司产品；Klenoa公司产品；脂质体为Invitrogen公司产品；Epics XL型流式细胞仪为Coulter公司生产；实时定量PCR试剂购于TaKaRa公司。实时定量PCR仪MJ Research Opticon2TM为MJ公司产品；BDFACS AriaTM为Becton Dickinson公司产品，用于细胞分选。 重组载体构建 CF7，T47D，人类结肠腺癌细胞株HT29，人类肝癌细胞株SMMC7721，人神经胶质瘤细胞株SHG44，人脐静脉内皮细胞转化细胞株ECV304，人类胚胎肾转化细胞株293细胞株均为本室保存，于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。含15%胎牛血清（FCS）（杭州四季青公司产品）的RPMI 1640（Gibco/BRL产品）完全培养液用于NB4、K562、U937、THP1、Jurkat、SHG44、ECV304、293、SMMC7721、MCF7、 T47D细胞的常规培养，SHI1细胞株培养于含15%胎牛血清的IMDM（Gibco/BRL）完全培养液中，HT29培养于含10%胎牛血清的Moca 5A（Gibco/BRL）完全培养液中。 细胞转染 ①电穿孔转染目的基因：取对数生长期的NB4、U937、SHI1、THP1与Jurkat细胞1×107，将细胞悬液与20 μg质粒DNA（分别是pEGFP1、pECF7、T47D、ECV304、SMMC7721、SHG44、HT29和293细胞。转染48小时后，1∶10传代并用合适剂量的G418筛选。 绿色荧光蛋白平均荧光强度的检测 收集2×106细胞，用1×PBS洗涤2次，加入完全培养液1 ml，在Coulter公司Epics XL型流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的平均荧光强度。上机检测前，再用1×PBS洗涤2次。激发波长为488 nm，释放波长为507 nm。 EGFP基因转移效率的鉴定 稳定转染pE的分析软件在BDFACS AriaTM流式细胞仪上对K562/pEJ Research Opticon2TM荧光定量PCR仪上检测EGFP拷贝数，并以β2MG基因的拷贝数进行标化。优化的EGFP的检测体系为： 5×PCR 缓冲液 5.0 μl，250 mmol/L MgCl2 0.6 μl，10 mmol/L dNTPs 0.75 μl，20×SYBR Green I 1 μl，12.5 μmol/L引物各0.5 μl，5 U/μl HS Taq DNA聚合酶0.25 μl，DNA 1 μl (相当于50 ng的基因组DNA)，反应总体积为25 μl。反应条件为： 94℃ 5分钟； 94℃ 45秒；63℃ 1分钟, 38个循环，分别于78℃和85℃时采集荧光信号。EGFP的引物序列： E1: 5CACCATGGTGAGCAAGGGCG3，E2: 5CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC3 ，产物730 bp。基因组DNAβ2MG基因的序列： 正义链: 5CAGGTTTACTCACGTCATCCAGC3 ，反义链: 5TCACATGGTTCACACGGCAGGC3，产物 235 bp。 转基因细胞株中EGFP的表达水平实时定量PCR检测 为了评估转基因细胞中流式细胞仪检测的EGFP的平均荧光强度与转基因细胞中EGFP mRNA水平的相关性，利用实时定量PCR检测转基因细胞株中EGFP的表达