TATEGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性论文.docVIP

　　TATEGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性论文 王海珍 许予明 李增富 杨静 张云汉 【摘要】 目的： 构建pET28aTATEGFP重组子,观察表达的融合蛋白TATEGFP在细胞内的转导活性. 方法： 人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段，插入载体pET28a后再连接EGFP基因，组成pET28aTATEGFP重组表达子. 转化大肠杆菌，IPTG诱导TATEGFP融合蛋白表达，组氨酸亲和层析柱纯化. 将融合蛋白加入培养的PC12细胞，观察荧光进入细胞的情况. 结果： 成功地构建了高表达pET28aTATEGFP重组子，纯化了分子质量约为29 ku的融合蛋白TATEGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TATEGFP融合蛋白穿透生物膜的能力. 结论： 通过对TATEGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用，为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础. 【关键词】 TAT 蛋白转导结构域 重组融合蛋白质类 PC12细胞 0引言 随着生物工程技术的迅速发展,蛋白质与多肽类药物相继出现.freelain, PTD ). TAT的发现在蛋白功能和疾病治疗的研究中具有重要的应用价值. 我们利用增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）作为报告蛋白，通过构建TAT与EGFP的融合表达载体，利用组氨酸亲和层析柱纯化TATEGFP融合蛋白,并与培养的PC12细胞作用，观察能否穿过生物膜屏障,探讨TAT作为跨膜的细胞内传递作用，为蛋白类生物大分子的应用提供了理论基础. 1材料和方法 1.1材料pET28a质粒、E.coli BL21 (DE3) (Novagen 公司)；质粒pEGFPN3，PC12细胞株由本试验室保存. T4DNA连接酶、NheI， XhoI，EcoRI，IPTG（华美生物工程公司）；质粒DNA小量纯化试剂盒（大连宝生物公司）；组氨酸亲和层析柱、咪唑（Pharmacia 公司）；凝胶图像分析仪（美国Syugene公司）；HD1000核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）； TAT双链与EGFP的引物合成及DNA测序由上海生物工程公司完成. 1.2方法 1.2.1TAT的合成按照TAT蛋白转导区4860位氨基酸（YGRKKRRQRRR）的序列，人工合成了编码PTD的DNA片段：正义链为5′AAAgCTAgCggCTATggCCgTAAAAAACgTCgTCgTCgTggCgAATTCAAA 3′，下划线分别为NheI， EcoRI酶切位点，反义链略. 两段DNA片段在95℃变性30 min后，置于90℃水浴的保温瓶中缓慢退火过夜，退火后得到双链片段. 1.2.2 EGFP的PCR引物设计以pEGFPN3为模板设计引物，上游引物: 5′AAAgAATTCATggTgAgCAAgggCg AggAg 3′，下划线为EcoRI酶切位点. 下游引物: 5′TTTCTCgAgTTACTTgTACA gCTCgTCCATg 3′下划线为XhoI酶切点. 1.2.3EGFP的cDNA片段的扩增以pEGFPN3为模板进行PCR扩增，反应体系为25 μL,分别加入引物、Taq酶、dNTP，10×Buffer等. 扩增步骤如下:94℃变性5 min, 50℃退火45 s,.freelin,循环28次,再94℃变性1 min . PCR反应产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切后回收EGFP的cDNA片段备用. 1.2.4pET28aTATEGFP与pET28a EGFP重组质粒的构建将TAT双链片段经NheI，EcoRI双酶切后回收，与经同样酶切回收的Pet28a载体连接，构成pET28aTAT重组质粒. 重组质粒用EcoRI, XhoI双酶切消化, 由T4DNA酶定向插入连接备用的EGFP片段，转化感受态细细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒，经酶切鉴定得到正确的重组融合表达载体pET28aTATEGFP. 同时参考以上方法构建对照质粒pET28aEGFP. 1.2.5pET28aTATEGFP在大肠杆菌中的表达及纯化质粒转化E.coli BL21,形成稳定的高表达细菌株. 在含0.05 g/L卡那霉素的LB平板上划单菌落，挑取单菌落至3 mL的LB培养液中放大培养,细菌生长至对数期加1 mmol/L IPTG诱导4～5 h ,收集细菌, PBS漂洗2次. 超声裂菌，4℃, 12 000 g离心15 min，沉淀主要为包涵体,将包涵体溶于8 mol/L尿素溶液中，在AKTAprime上用NiNTAagarose亲和层析柱进行纯