RNA体外干扰肝癌Hep 3B细胞VEGF基因的表达论文.docVIP

　　RNA体外干扰肝癌Hep 3B细胞VEGF基因的表达论文 蒋冬贵 夏昆 刘劫 罗红 潘乾 龙志高 夏家辉 【摘要】 目的： 通过自主构建的RNAi载体和体外合成siRNA的方法，寻找能有效干扰VEGF基因表达的载体和siRNA片段治疗肿瘤. 方法：将自主构建的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2，以及体外合成的T: To construct RNAi plasmids and synthesize siRNA in vitro, transport them into Hep3B cells, so as to find some effective VEGF RNAi plasmids and siRNA segments. METHODS: The RNAi plasmids pcDUVEGF1, pcDUVEGF2 and siRNA segments TI 1640干粉培养基购自Hyclone公司，脂质体2000 Invitrogen公司. T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System（Promega公司）；Klenoent（Takara公司）；DEPC（Sigma公司）. Trizol Reagent(Gibcol BRL);174 Hinc digest DNA Marker，Taq酶宝生物工程有限公司；AMV逆转录试剂盒（Promega公司）；蛋白质Marker（上海生化试剂公司）；Xfilm（上海爱克发感光器材有限公司）VEGF ELISA检测试剂盒（Diognostics Systems公司）；兔抗人VEGF多抗（NEOMARKERS公司）；山羊抗兔二抗（PKD公司）. 1.2方法 实验组为pcDUVEGF1，pcDUVEGF2阳性克隆和转染Tvegf1，Tvegf2 siRNA的Hep3B细胞，对照组为常规培养的Hep3B细胞. 用Apa I 和BamH I双酶切pcDU6质粒，分别取RVEGF1，RVEGF2的Reverse,ForH I和Hind III双酶切，将RVEGF2连接到带有RVEGF1的质粒上并测序证实，命名为pcDUVEGF1. 将RVEGF3和RVEGF4连接pcDU6质粒上并测序证实，命名为pcDUVEGF2. 将T7 promoter分别与TAXTM Express Large Scale RNA Production System试剂盒体外合成双链的RDNA，按TI 1640液中,室温30 min后转染Hep3B细胞. siRNA转染Hep3B细胞24 h后换无血清培养24 h，取上清行PI1640培养基重悬. 当T25培养瓶细胞汇合率达到90%～95%时换液，PBS洗涤，各取20 μL脂质体和20 μg pEGFPN1（用以了解脂转效率）,pcDUVEGF1 和pcDUVEGF2质粒混匀5 min后加无血清RPMI 1640培养基800 μL混匀后加入到上述T25瓶培养的Hep3B细胞上，50 mL/L CO2，37℃温箱培养24 h后加G418（800 mg/L）筛选. 将阳性克隆加有血清RMPI 1640培养基重悬并转移到6孔板中培养. 用Trizol抽实验组和对照组细胞的总RNA，同时用一对βactin引物做对照，做半定量RTPCR. 经电泳图像分析扫描得到VEGF与actin条带峰面积积分值比值作为计算VEGF PCR产物相对定量,比较实验组和对照组VEGF mRNA的表达丰度. 1.2.2VEGF蛋白的检测将实验组和对照组的变性上清跑100 g/L的PAGE胶，用Marker及阴阳性对照，行PI 1640培养基培养24 h,取上清冻存于-20℃. 用VEGF ELISA检测试剂盒的检测实验组和对照组的Hep3B细胞分泌的VEGF的量. 1.2.3Hep3B细胞生长曲线的测定将筛选出的RNAi阳性克隆细胞（包括空载体pcDU6）和转染siRNA（转染24 h后）接种于96孔培养板中，设空白对照（不含细胞的PBS）进行MTT法测细胞的活力. 测定570 nm处的吸光度A值，A值的大小反映Hep3B细胞成活数量及活性. 以时间为横坐标（d ），减去空白对照的吸光度A值为纵坐标绘制生长曲线图. 统计学处理:SPSS10.0软件进行t检验和F检验. 2结果 2．1RNAi质粒和siRNA对VEGF mRNA表达的影响构建好的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2质粒，体外合成的Tvegf1和Tvegf2 siRNA. βactin为内参照,按100 ng/mL培养基的Tvegf1,Tvegf2作用于He