rhuCD40L对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用论文.docVIP

　　rhuCD40L对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用论文 朱小朝 周广军 时坤 穆向明 【摘要】目的：通过动物体内实验研究证实rhuCD40L对人结肠癌的治疗作用，从而进一步探讨其抗肿瘤机制。 方法：将皮下接种HT-29人结肠癌细胞后建立人结肠癌模型的20只裸鼠随机分为二组，治疗组以rhuCD40L作皮下注射；对照组以生理盐水作皮下注射，定期观察裸鼠的生活状况并测量其体重，治疗5周后处死裸鼠并取瘤，测量两组瘤大小及瘤重，并比较结果。 结果：20只裸鼠全部成瘤，实验过程中所有裸鼠生活状况均良好.freelan Chemical公司。 1.4细胞培养与传代: 以下各项操作均在无菌细胞培养室的超净工作台中进行。人结肠癌HT-29细胞于McCoy’5A培养基（含10%新生牛血清）中维持，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，细胞为单层贴壁生长，待贴壁细胞融合达70%～80%时以胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化传代。 1.5收集细胞并接种裸小鼠: 将处于对数生长期的细胞以胰酶消化后用无血清McCoy’5A培养液稀释成细胞悬液，离心、弃去上清，再以无血清McCoy’5A培养反复洗涤、离心3次，弃上清，以无血清McCoy’5A培养液稀释细胞并调整细胞浓度至3×107/ ml；取该细胞悬液0.1 ml/只均注射于裸鼠右上肢根部的背部皮下。 1.6分组治疗: 待肉眼可见裸鼠接种部位有肿瘤长出后，将20只裸鼠随机分成二组，每组10只。A组（对照组）：以生理盐水0.5ul/g/日作肿瘤周围皮下注射，1次/日，3日为一疗程，每周一疗程，共5周；B组（治疗组）：以rhuCD40L0.5ug/g/日作肿瘤周围皮下注射，1次/日，3日为一疗程，每周一疗程，连续治疗5周。 1.7分别于治疗后第1、3、7、14、28、35天用游标卡尺测量每个肿瘤大小，并重复测量三次，取平均数，以下述公式计算肿瘤体积：V=ab2π/6 a：肿瘤结节的最大直径 b：肿瘤结节的横经，末次测量后脱颈处死裸鼠，切除肿瘤称重。治疗期间还要连续观察裸鼠的饮食、大小便、精神、活动与消瘦等情况。 1.8 统计学方法: 所有数据以 ±s 表示,用SPSS 15.1统计软件包进行统计学分析，检验水准为0.05。 2结果 2.1 本实验用20只裸鼠均于HT-29人结肠癌细胞皮下接种后4～5d在接种部位出现直径约0.4 cm大小的肿瘤结节，成瘤率为100%。所有裸鼠治疗期间均未出现明显的活动减少、食欲减退、恶心、呕吐、反映迟缓、精神萎靡、消瘦等现象。实验结束时无一裸鼠自然死亡。实验中的裸鼠图片见图1。 2.2 治疗过程中肿瘤生长趋势图见图1（根据治疗过程中所测得的肿瘤体积数据 2.3 治疗结束后测量肿瘤体积值见表1。 分组动物数（n）瘤体积（㎝3）A组102.028±0.047B组100.767±0.007t=77.18, p 0.05 2.4 治疗结束后各组肿瘤重量比较见表2。 分组动物数（n）瘤重（g）A组101.992±0.224B组100.982±0.410t=68.412, p 0.05 3 讨论 CD40是肿瘤坏死因子受体( tumor necrosis factor receptor，TNF． R ) 家族的成员， 表达在B淋巴细胞、单核细胞、造血干细胞、树突状细胞(DCs)、内皮细胞、上皮细胞等表面。CD40配体(CD40ligand，CD40L)也称CD154，是肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员，主要由活化的CD4+T淋巴细胞表达。CD40L与CD40的相互作用可以直接抑制人的乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌、非小细胞肺癌和鳞状上皮癌等的生长，此作用与 CD40L能够诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞和／或凋亡有关。CD40L还能诱导DCs细胞表型和功能的成熟，可以通过上调共刺激因子的表达及细胞因子的分泌来增强上皮性肿瘤的免疫原性。许多模型中都证明了CD40L具有刺激机体抗肿瘤免疫反应的能力。Rong等报道，使用同时编码癌胚抗原(CEA)和CD40L三聚体的疫苗成功地在CEA转基因小鼠体内诱导出对鼠结肠癌的有效的保护性免疫反应，在这一过程中，观察到未经抗原刺激的T细胞和DCs的活化［3］。在鼠的同源实体瘤模型中，直接将 ADV-CD40L注射入小鼠皮下接种的B-16黑色素瘤、 MCA-1肉瘤或者CT-26结肠癌中，均能在大部分荷瘤鼠得到肿瘤消退的效果［4］ 。使用编码 CD40L的复制缺陷型腺病毒(ADV-CD40L)，能够使得慢性 B淋巴细胞白血病细胞和原滤泡淋巴瘤的细胞增强共刺激分子的表达［5］［6］。这些细胞刺激T细胞增殖的能力都被显著增强［7］。 rhuCD40L是可溶性重组人的CD40受体配合基，以增加稳定的异白氨