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布鲁氏菌基础知识及本室研究现状 布鲁氏菌病 布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病是由布鲁氏菌属细菌引起的一类世界范围内流行的人畜共患传染病。严重危害着人类和多种动物的健康。布鲁氏菌可以引发人和牲畜及野生哺乳动物的感染，尤其牛、绵羊和山羊等家畜易染，给畜牧业带来巨大的经济损失。 一 布氏杆菌概述  布鲁氏菌病又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大,被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状 1887年英国医生布鲁氏首先从死于“马尔他热”的英国士兵脾脏中分离出羊种布氏菌。  布鲁氏菌属（Brucella)，包括6个种19个生物型： 牛种布氏菌：1、2、3、4、5、6、7、9型 羊种布氏菌：1、2、3型 猪种布氏菌：1、2、3、4、5型 鼠种布氏菌 绵羊附睾种布氏菌 犬种布氏菌 1、形 态 布鲁氏菌是一组微小的球状、球杆状、短杆状细菌； 宽约0.3—0.5微米、长0.6—1.5微米。电镜下见到的羊种菌为明显的球杆状、牛种菌和猪种菌为短杆状； 6种布鲁氏菌靠形态很难区分，一般来说，羊种菌最小，牛种菌次之，猪种菌较大； 布鲁氏菌没有鞭毛，不形成芽胞和夹膜。 2、染 色 涂片染色检查多为单个排列，少见成对短链排列。 布鲁氏菌可被碱性染料着色； 革兰氏染色阴性； 用0.5%沙黄水溶液染色，加热出现气泡，水洗后用0.5%孔雀绿或1%美兰复染，布鲁氏菌呈红色，其它细菌呈绿色和兰色。 布鲁氏菌用柯氏染色染成红色 3、培养特性 1.布鲁氏菌培养营养要求高： 需要各种氨基酸和各种金属离子，有的菌种需要血清才能生长。 2.生长缓慢：一般需经4—6天，有的甚至21—30天才能长出菌落。 3.生长所需温度：20—40℃，最适为37℃,超过42℃则不生长。 4. C02: 绵羊附睾种菌和牛种菌的某些生物型菌需严格的C02(5～10％)。 4 细菌变异 布氏杆菌在各种理化因素作用下易发生变异;即从光滑型（S）变为非光滑型——粗糙(R)或粘液(M)状。 变异菌落常比光滑型稍长，表面有颗粒。菌落颜色为灰白色或褐色， 5 抵抗力  布氏杆菌在合适条件下能生存很长时间，有较高的抗灭活能力。 对湿热、紫外线和各种射线以及常用的消毒剂、抗生素、化学药物比较敏感； 对低温和干燥有较强的抵抗力，故可用冷冻真空干燥法保存菌种。 二、从牲畜材料中分离布氏菌 从牲畜流产胎儿检菌 从胎衣检菌 从阴道分泌物检菌 尿液检菌 乳汁检菌 脓汁检菌 血液培养 脏器检菌 布鲁氏菌常用分离用培养基 血清葡萄糖琼脂培养基 胰酶大豆培养基 土豆琼脂培养基 布病组阶段性成果 1.布鲁氏菌强毒株与弱毒株基因组 DNA差异基因筛选与鉴定 应用代表性差异分析技术对流产布鲁氏菌强毒株 544 A 和弱毒株 104 M 进行基因组差减分析获得强毒株特有的 9 条差异片段和弱毒株特异的 17 条差异片段。经 BLAST 分析和PCR 鉴定，最终证实 3 条差异片段，与流产布鲁氏菌经典弱毒株 S19 同源性在 98 %～99 %之间，只在弱毒株104 M 基因组中检测出，而在强毒株 544 A 中不存在。该实验为建立布鲁氏菌自然感染菌与疫苗株的基因鉴别诊断方法奠定了基础. 2 牛布鲁氏菌病噬菌体展示抗原的制备及其在诊断中的应用采用噬菌体随机12肽库模拟布鲁氏菌抗原表位，经健康牛血清反复多次预淘选之后，再以临床分离的布鲁氏菌阳性混合血清IgG为靶分子，进行了正常的3轮生物淘选，挑取单平板内所有50个噬菌体克隆，提取单链DNA并测序。运用间接ELISA方法、竞争抑制ELISA方法及Western-bloting方法分别鉴定测序得到的不同噬菌体克隆的亲和力、特异性及反应原性。最终得到两个亲和力高且特异性好的噬菌体克隆，命名为P2和P14。 将特异性噬菌体P2和P14为检测抗原直接包被酶标板建立牛布鲁氏菌抗体检测的间接ELISA诊断方法，该方法特异性好，灵敏度高，与传统虎红平板凝集试验检测方法符合率为96.7% 。采用胶体金免疫层析技术，使用胶体金标记G蛋白制备金标垫，以高特异性混合噬菌体克隆包被NC膜作为检测线，采用间接法原理组装了布鲁氏菌抗体快速检测胶体金试纸条，检测符合率分别为97.5%和97.8%。为布鲁氏菌病血清学诊断提供了一种特异性强、灵敏度高、简单快捷的检测方法。 3.一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法 该发明公开了一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法，涉及一种人畜共患传染病病原体的基因检测技术，适用于布鲁氏菌定性检测。本发明由标准阳性模板 PCR反应液﹑布鲁