大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶rGloshedobin+在大肠杆菌中的克隆、表达与分离纯化论文.pdfVIP

I029 大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶r-Gloshedobin 在大肠杆菌 中的克隆、表达与分离纯化 杨青 许建强 雷旭宇 李民 包永明 安利佳 (生物科学与工程系生物工程研究所 大连理工大学，大连116024) 引言 自从1967 年Esnoff 在Agkistrodon rhodostoma 中发现了类凝血酶Ancrod ，多种蛇毒类 凝血酶已经从不同种类的蛇毒中分离得到[1] 。由于其具有将纤维蛋白原特异性水解为非交联 的纤维蛋白，而后者对胞浆素的溶素作用比凝血酶诱导交联凝块作用更加敏感，非交联的纤 [2] 维蛋白很容易被血浆降解 。 这些丝氨酸蛋白酶可以被用来预防在修复术装置和额外物体 装置的外表面形成血栓或降低血液粘度以期改善各种血管紊乱症中的血液循环状况[3] 。 由 于大多数来源于天然蛇毒纯化得到的类凝血酶的数量无法满足 生化和分子生物学的方面的 研究，通过基因工程手段获得这些蛋白酶将是当务之急。 1991年Maeda等研究者将batroxobin基因[4]成功克隆到大肠杆菌。迄今为止，已有多种类 凝血酶包括Batroxobin, Mucrosobin, Pallabin 和Acutin 等在微生物体系中获得表达产物 [4,5,6,7] 。与其他大多数外源蛋白质在大肠杆菌中表达的情况相比较，类凝血酶也存在伴随着 多肽链折叠易于形成无活性的蛋白质聚集体的问题。虽然包涵体形成既可有效防止细胞内蛋 白酶对新生成外源蛋白质的降解又能简化分离纯化过程， 但是对于多数研究者而言，以活 性可溶形式表达外源蛋白质才是所面临的重大挑战。 Lavallie 曾报道以硫氧还蛋白 TrxA(thioredoxins)作为融合部分可以提高外源蛋白质表达时的稳定性，并避免了包涵体的形 [8] 成 。 [9] 本研究采用来源于大连蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis)毒腺的类凝血酶Gloshedobin ， 通过调控外源基因表达的环境条件包括诱导温度和诱导时间等，在大肠杆菌细胞质中获得了 类凝血酶可溶性表达产物。而且, 通过向培养基中添加 Mg2+ ，可溶性类凝血酶表达量提高 了50% 。 1 材料与方法 1.1 使用RT-PCR 合成扩增cDNA 在大连蛇岛获得蛇种，经鉴定属大连蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis) 。取出大连蛇岛蝮 蛇毒腺，立即加入Trizol 试剂 (Gibco Brl., USA)进行组织匀浆。根据产品说明书提供的方法 提取出4 µg 总RNAs 。将1 µg 总RNA (含有 4-5 ng mRNA) 置于 65 °C 温浴 10 min 然后 快速转移放置在冰上。根据生产商提供的使用说明合成 cDNA 。设计两个引物 TLE-F1 和 TLE-M13M4(Tab.1) ， 使 用 Takara 公 司 开 发 的 RT-PCR kit (reversed transcription-Polymerase-cyclic amplification kit) 进行RT-PCR ，获得全序列。 使用双脱氧法 进行序列测定。 Table. 1. Synthesis of the primers used in this study. primer sequence TLE-F1 5′-ATGGTGCTGATCAGMGTG-3′ TLE-M13M4 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′ TLE-Upper 5-GGGAATTCATCATTGGAGGTGATGAATG-3 1 TLE-Lower 5-GTCTCGAGTCATGGGGGGCAGGT TGCAT-3 1.2 表达载体的构建 类