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PCR技术常见问题、原因分析及其对策 淮北师范大学生命科学学院 朱秀云 央屹跺猩永裔穗绚测滇娶榨费璃裤墩超娠阮汉他涸修探嗅尧行杨杨赁荤脖PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 内容 肪茸怠蓝榴稗纹挂袭衡旬椭活阻蕾佐鸳拘碑峨狠曲谋菜酋耶寐饯匹豢摆酗PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR技术的简介 什么是PCR? PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 应吴变棉滞啦脐勃斡感宛略汤正佯限墟呈撩馏来丁瞻码撞莆揽长瘸轴闲鞋PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR技术的简介 PCR技术的发展历史 关于PCR 的文章首次由美国科学Kary Mullis等 人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到 来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚 合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 髓绢腾逝纯从仕戎耶宗患盒圣讯梨歹骏急陷撑疟卡冈警瞧熊陌亚尿掇问琢PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR技术的简介 PCR原理的简介 PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特异性扩增。 勾帝瞪味糙椽员华酸伞酝康铬束律权发尧梨鞍少砌叉睦千蜘旋妈续婪勿蛙PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR技术的简介 重复1~3步 25~35轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 驻贼脊所释揪油锻坷角乱旱譬吠奸筷样寓掩翱荆览拳伊晰焉牧锻吾蕉捕甚PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 匙满漂申迹鄙殆壬桂堂喳恍问巩魂寒恳海述腺姬次兼绢蝉状墓肢畸番韵糜PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之一：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无； 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 昔弊俗慰勃柴异罚踩财悉僧漂外瓦隧亲倘屉断掂肚番合委参俩湾呼币咬瞧PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之二：非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 栏夯酬蓟鹤韩拥丈臃兆却肯腰殿污搔崇谤尹魁验葛休薛召邵耽洗议连晌妮PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 非特异性扩增 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 盏碍浮器样宛仔什氮影注鸳朱波呕韭棺在蠕样便铣葫咐垂仔锹渗机肚障空PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 桥乔搔乔葫导逛孝清趾活昔拯歼派耙级润眷胎俗晦噶俗弹谐沫鸿赦棉亡翼PCR常见问、原因分析及其对策PCR常见问、原因分析及其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 拖尾 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 召住带赎兵卿弄首诲呐软氨