化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植.pdfVIP

第25卷 增刊 2006年9月 Vol.25，Sup. JournaNlofGuuangxAiAgr,an}Biol.Science Sept.,2006 文章编号:1008-3464(2006)增一0201-02 化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植 杜卫华’·“，李世杰 “·“，郑敏 ，‘戴蕴平’，李宁 ‘ U 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京 100094;2 中国农科院畜牧所胚胎工程与繁殖技术室 北京 100094;3 河北农业大学生命科学院，河北保定071001) 摘要:卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂，使其所有染色 质通过纺锤丝牢固结合，并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外，达到去核目的。目前以 化学去核处理的MII期卵母细胞为受体，已获得克隆小鼠。然而，第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞 经化学去核后，进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比，该方法对卵母细胞无机械损伤，完 全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时，程序简单，所 得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。 剪取超排小鼠的卵巢，以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体，进行体外成熟 培养。成熟培养5h后去除卵丘细胞，挑选生发泡破裂的细胞顺序移人含脱拨秋水仙碱 (DC, 0.4pg/ml_,2h)和DC(0.4jig/L)+放线菌酮 (CHX,50jig/ml_)的M16培养液中继续培养，直 到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素 ((PHA,200pg/mL)粘合后，转人电击 槽;施加1个5V/mm,3ps交流电脉冲和2个92V/mm,70et.直流电脉冲进行电融合。3h后，W SrCl:激活6h，于四孔培养11n中制作的 “孔中孔”(wellofwell)体外培养重构胚。 试验重复3次，共计698个卵母细胞，获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8写和93.6%;胚 胎2一细胞发育率为24.7%,4一细胞率为6.74%;2一细胞期克隆胚移植假孕受体后，没有获得怀孕受体。 试验分别以 “血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植，结果表明，冷 冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P0.05);激活率、 2一细胞和4一细胞发育率，则三组间差异不显著 (P0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合， 完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序，属手工克隆，它的成功将会大大简化核移植程序，同 时提高了核移植的生产力，最终提高核移植总效率。 关健词:化学去核;小鼠;无透明带技术;体细胞核移植 中图分类号:S814-8 文献标识码:A 收稿日期:2006-08-13, 基金项目:国家8“计划项目 (2001AA213091);北京市自然科学基金重大项目 (5030001) 作者简介:杜卫华 ((1974一)，女，山西太谷人，助理研究员，博士;E-mail;dwh679@. 202 广 西 农 业 生 物 科 学 第25卷 Reconstructionofmouseembryoswithchemicallyenucleatedoocytes DUWei一hua`，-IIShi一jie2.3，ZHENGMin，DAIYun一ping，I.INing (1StateKeyLaboratoryforAgrobiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China; 2 InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100094,China; 3 CollegeofLifeScience，HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001，China) ·Abstract:Inducedenucle