1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒HA基因的序列分析.pdfVIP

第六届理事会第二次会议皿教学专业委员会2006年会议论文集 1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒HA基因的序列分析 王伟利1，周宇2，赵丽2刘明3，钱爱东2 (1吉林出入垅检脸检痰局，吉林 长春 130062; 2吉林农业大学，吉林 长春130118; 3中国农业科学院哈尔滨兽医研究所善医生物技术国家重点实脸室，黑龙江 哈尔滨 150001) 摘 要:本研究时1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素 (HA)基因进行扩增、克隆，然后对毒株的HA 基因阳性克隆鉴定、序列测定与分析.结果表明:所扩增的片段长1707bp，包含了完整的开放阅读框架， 编码568个羲基酸二该毒株与A/chicken/Jilin/9/2004.A/goose/Guangdong/3/96和A/HongKong/156/97HA基 因序列比较分析结果表明:核普酸同源率分别为98.4%,97%和%.8% ;氛基酸同源率分别为99.1% 97.2%和97%，受体结合位点的氛基酸均相同.该毒株有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点附近有6 个碱性氛基酸序列插入. 关键词:鹅;禽流感病毒;血凝素墓因;序列分析 禽流感是A型流感病毒引起的一种禽类 (家禽和野禽)感染和域疾病综合征。该病毒 感染鸡、火鸡、鸭、鹤鹑等家禽、野鸟、水禽和海鸟等的感染。禽流感病毒是分节段的负链 单股RNA病毒，在复制过程中很容易发生基因突变及基因重组，因而决定了AIV具有众多 血清型和高度变异性，在结构蛋白中血凝素 (HA)的变异最频繁，己经证明HA蛋白是禽 流感病毒发生变异的主要因素;HA蛋白也是诱导动物机体产生中和抗体的主要免疫原，是 病毒变异、毒力和宿主特异性的主要因素[1-21。因此研究HA糖蛋白具有重要的意义。本研 究对一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒株进行克隆与序列分析，从分子流行病学角度进一步分 析其来源及其演化[3-61，为政府有关部门监控禽的流行与防治提供科学依据。 1材料与方法 1.1病毒毒株 1株鹅源HSN1亚型禽流感毒株，A/Goose/Jilin/l/2004(HSNI)简称为G由中国农业科 学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室提供 ‘数据库的参考毒株 A/goose/Guangdong/3/97(H5N1),A/HongKong/156/97(H5Nl),A/chicken/Jilin/9/2004分别简 称为GD3(H5N1),HK156(H5NI)和JL(H5N1),GeneBank登录号分别为AF364334,AF046088, AY653200a 1.2载体和菌种 克隆载体pMD18-T,JM109大肠埃希氏菌感受态细胞购自宝生物工程有限公司。 1.3试剂 病毒RNA提取试剂Trizol,cDNA反转录试剂禽源反转录酶AMV购自promega公司: ExTagDNA聚合酶、限制性内切酶HindHI,XhoI、胶纯化回收试剂盒、DNAMarkerDL2000 等购自宝生物工程有限公司;质粒提取试剂盒购自鼎国生物公司。 1.4引物合成 根据禽流感病毒已知的基因序列，设计合成一对引物。 P1:5’一GTCAAGCTTCAACCATGGAGAAAATAGTGC-3 P2:5’一CGCCTCGAGTTAAATGCAAATT CTG-3 所设计的上述引物由大连宝生物公司合成。 1.5病毒RNA的提取 按病毒RNA提取试剂Trizol说明从禽流感病毒的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA.. 1.6HA墓因的RTPCR扩增 根据设计合成的引物 ，采用cDNA反转录试剂禽源反转录酶AMV，按说明进行反转 录成cDNA，然后以cDNA为膜板按以下程序进行PCR扩增:94℃预变性4min，94℃变 性40s,490C退火 60s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10mino.结束后取PCR产 物5gl，在1%琼脂糖凝胶上电泳检查结果。 ·373- 禽类传染病 1.7HA基因的克隆与鉴定 PCR产物用胶问收试剂盒回收，与pMD18-T载体连接，转化JM109大肠埃希氏菌感 受态细胞内，然后取100川菌液涂布于含氨节青霉素的LB平板上，370C培养16h;挑取白 色菌落接种于5mL