犬冠状病毒流行株膜蛋白基因的分子进化分析及其表达研究.pdfVIP

第六月班布金第二次会谈.橄，专业典员会2006年会谈论文维 犬冠状病毒流行株膜蛋白墓因的分子进化分析及其 表达研究， 叫朴，，~ 1..，杨麟1朴伟1，翔林，，胡料:，黄知· (1.中国人民解放军军亨医学科学陇军字菩医研究所，吉林长券130462;2.古林农业大学动物科技学院， 古林长春 1‘3011执 3.中国农业科学陇兰川菩医研究所，甘方兰州730046) 摘 共:对国内分离的犬冠状病毒 (ccv)DXMV.V1和V2流行株膜蛋白(M)基闷难行了扩姗、浏序 和遗传进化分析.3个ccv流行林ml基因全长均为792bp,编玛263个氛基映，其中前17个孰基映为信 号肤.DXMV,VI和V2流行株与Insavc-1痰苗株m基因相比，核等鹉的再派性分别玲92.60/a、90.A O g 和91.6%，推导的氛基映序列的同源性分别为92.5%.92.01/o和92.3% ，其史异主要在出现M基因前3 l l 区城内，其中74-76,120.124和131135三个区城史异校大.国内、DXMV.Vi.V2.NJi和NJI-175十 流行林M基困核普映用泽性为孤石%，推手的氛基故序列月派性为%.4%,显示出很高的保守性.基于m 基因的分子进化分析表明，目访四内绝大多数ccv流行株娜属于ccv墓因11型，只有Fox3-1和Rsc2-1 两个流行株为基因I型.另外，将DXMV株M基圈亚充隆到pET28a中，在$L21(DE3)中实现了1u蛋白 包洒体形式的表达，表达亏灼占蔺体蛋白的10.2%. 关价姗 火冠状病毒 成蛋白基固 分子进化分析 表达 犬冠状病椒CaninecorolKlvilZIS,CCV)属冠状病毒科冠状病毒属血清I群成员之一，主要 弓I起幼犬发生以胃肠炎为主要特征的急性传染脚1,21，也可感染一些珍稀野生动恻l，是当 前对我国养犬业和野生动物保护业危害较大的一种病原。目前，主要通过疫苗接种来控制 ccv感染，然而由于我国对ccv研究的起步较晚，国内夏咸柱等人1996年才首次分离出 此病毒例，因此对该病毒国内流行株的分子生物学特征和是否发生变异尚不清楚。在本研究 中，我们对国内分离的3个ccv流行株m基因进行了测序和分子进化分析，并在E.coli中 进行了表达，为ccv的分子流行病学和诊断试荆的研究莫定了一定的签础。 1材料与方法 1.1病毒 CCVDXMV株是本实验室从四川某大熊猫保护中心病死的一只大熊猫肝脏中用CRFK 和F81猫肾传代细胞分离得到的;vi株和V2株是分别从长春和哈尔滨两地的发病犬肝脏 中分离得到的。3株流行株均经系统的病毒学鉴定后保存. 1.2主共斌荆、质粒及.株 TaqplusDNA聚合阵、DMA脚ExtractionKit和dNTPs购自上海生物工程公司。TrizoL 和反转录醉SuperScriptmIIRNaaeIT购自Invitrogen公司。RNmni,T4DNA连接酶、限制 性内切醉购自大连TaKaR.公司-pGEM-T载体购自Prome，公司。DE 培养基为GIBCO 产品;大肠杆菌表达载体pET28a、克隆宿主菌JM109和表达宿主菌BL21(DE3)由本室保存。 ccv多克隆抗体由ccv细胞培养物超离浓缩后经4次免疫健康犬而获得，其中和抗体效 价为1:1280 1.3引物设计 根据GenBank中报道的CCVInsrIC-1株腆蛋白(M)墓因序列，设计了以下一对特异 性引物。P1:5-TACKACCACCATGAAGAAAATTrlGTTTITACTAGCG-3;P2:51-CTGCG GCCGCTTATACCATATGTAATAATTTTTC-3.为下一步克隆孺要，分别在上、下游引物中引 入KpnI和NotI醉切位点，并加有两个保护性碱墓。引物由大连TaKaRa公司合成。 1.4病毒的培养及总RNA的提取 将DXMV.VI和V2野毒株按1/10比例接种于单层的F81猫肾传代细胞中，用含8% 犊牛血清的DMEM液进行培养。待50%的细胞出现CPE时，用TrizoL按常规方法提取总 RNA. 1.5CCV流行株M基因的RTPCR扩增、序列测定及分子进化分析 以提取的总RNA为模板，以P2和Oligo-T为引物按常规方法用反转录酶SuperScriptmlii