细胞生物学实验指导 主编 巴雪青 曾宪录 东北师范大学 生命科学学院 ....DOCVIP

细胞生物学实验指导 主编 巴雪青 曾宪录 东北师范大学 生命科学学院 目录 实验一 细胞生物学常用光学显微镜的了解和使用 实验二 常用电子显微镜的了解和使用 实验三 细胞膜通透性的观察 实验四 细胞表面黏附分子的荧光标记及观察 实验五 细胞的吞噬活动 实验六 动物细胞细胞骨架（微丝）的光学显微镜观察 实验七 动物细胞细胞骨架（微丝）的荧光显微镜观察 实验八 植物液泡系、线粒体的活体染色与观察 实验九 鸡血细胞的体外融合 实验十 哺乳动物细胞原代培养 实验十一 磷酸钙沉淀法将DNA导入哺乳动物细胞 实验十二 流式细胞仪的构造、工作原理及数据分析 实验一 细胞生物学常用光学显微镜的了解和使用 一、实验目的: 1、了解几种细胞生物学常用光学显微镜的构造及其性能。 2、掌握几种细胞生物学常用光学显微镜的正确使用方法。 3、在倒置相差显微镜下观察比较普通平场物镜和相差物镜下Hela细胞的形态差异。 二、引言： 世界上第一架具有科学研究价值意义的显微镜是十七世纪末英国物理学家胡克创制的，他首次观察了木栓的显微图象，并提出了细胞这一概念，当然，被他称为cell的镜下结构实际上是死掉的木栓细胞没有了原生质的、空的木栓化的细胞壁。真正观察到活细胞的是荷兰科学家列文虎克，他用自制的显微镜观察到了池塘水中的原生动物、人和哺乳动物的精子、细菌等等。可以说没有显微镜的发明就没有细胞的发现，也就谈不到细胞生物学的逐步发展。 光学显微镜在细胞生物学研究领域中发挥着越来越重要的作用，随着现代生物学技术与光学显微镜技术的发展，光学显微镜的种类也越来越多，现在，除了光学显微镜以外，已经研制出多种有特殊功能的光学显微镜，如相差、暗视野、荧光、干涉、微分干涉反差等显微镜。它们大都是在显微镜基本设计上发展衍生出来的，也就是在基本设备的基础上换用附设的专用组件或添加特殊专用装置，就成为能进行各种用途的一机多用镜，使光学显微镜的应用技术从单纯形态学研究扩展到动态地研究细胞结构与功能的关系领域。因此，简单了解这些特殊显微镜的原理、特点与使用方法，了解它们之间的差别和联系，对细胞生物学的研究将会带来许多方便和帮助。 三、实验内容： （一）倒置显微镜 (inverted microscope)： 倒置显微镜是一种为适应组织、细胞离体培养工作的显微观察的需要而发展起来的光学显微装置。它的特点是能直接对培养皿、培养瓶中的标本进行显微观察，它的光源、物镜、标本和目镜的相对位置刚好与经典的显微镜颠倒，因而称为“倒置”（图1－1）。 由于倒置显微镜一般常用于观察培养瓶（皿）中的未经染色的活体细胞，所以，常配备相差或微分干涉反差的物镜镜头，以及恒温装置以供细胞培养、环境条件实验和实时观测所用。如果需要对培养细胞进行荧光观察，则可配备激发光装置，和荧光物镜镜头，升级为倒置荧光显微镜。 （二）相差显微镜 (phase contrast microscope)： 在显微镜下镜检时，视场中的样品只有在反射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。 相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色给活体以有害的影响，甚至失真。由此，才使相差法显得异常重要。 20世纪30年代初德国物理学家泽尼克利用光波的衍射和干涉原理，使透过被检样本的直射光和衍射光的相位差转化为振幅差，制造了第一台相差显微镜，将人眼看不见的相位变化转变为看得见的振幅变化即明暗变化。 1．相差 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。 一般由于被检物体(如不染色的细胞)所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨出这种差别的。只有在变相差为振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。 当光波通过两种折射率不同的物质时，如由空气——水，或由空气——玻璃，其波长、振幅和相位皆有不同的变化。例如：光波分别通过lcm厚的水和lcm厚的玻璃时，由于两者折射率不同，通过它们的光波在相位上产生一定的差异。通过玻璃的光波相位落后，因为玻璃的密度和折射率比水大。所以，光波的波长和频率都小于水。 相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。 2．衍射与干涉 波在同一均匀媒质里传播是沿直线方向进行的，如果在它传播的方向上，遇到迎面挡住的孔或障碍物不比它的波长大得多，这时波就会明显地绕