利用RNAi沉默KIAA0280后对缺氧诱导大鼠神经元凋亡的影响论文.docVIP

　　利用RNAi沉默KIAA0280后对缺氧诱导大鼠神经元凋亡的影响论文 黄海潮，潘雪刁，金桂芳，巫玮，潘琴，石磊，臧林泉 【摘要】 目的 利用RNA干扰（RNAi）技术，观察脑缺血相关新蛋白KIAA0280被特异性沉默后对正常神经元和缺氧诱导神经元凋亡的影响。方法 取新生大鼠培养至5～7 d的神经元.freelal neuron and apoptosis neurons induced by hypoxia after blocking the KIAA0280 by RNAi technique. Methods Primary neurons of rats cultured for 5～7 d odel of neuronal apoptosis. After blocking the KIAA0280 by RNAi technique, the effects on the normal neuron and neuronal apoptosis induced by hypoxia e for 12 h, 24 h, the impacts on the normal neurons by the siRNA ent for 4 h and 8 h; it is found that, pared ple hypoxic group, the RNAi group ore sensitive and liable to be injured during apoptosis induced by hypoxia. Conclusion Application of the RNAi to silence KIAA0280 had certain impacts on the normal neurons and could promote apoptosis and death in the hypoxic-induced neuron apoptosis. It al neurons, and played a role in protecting hypoxia-induced apoptosis neurons. Key RNA荧光差异显示技术(mRNA fluorescence differential display)研究缺血时神经元在此应激条件下基因差异的表达，从中筛选出差异表达明显的基因（上调/下调基因），以明确防治脑缺血、缺氧相关疾病（心肌、器官移植、肿瘤等）的一个或者多个新靶点。前期工作利用MCAO造成大鼠缺血缺氧动物模型，免疫组织化学和EM高糖培养基、胰蛋白酶、优级胎牛血清（FBS）、马血清（HS）、B27、HEPEs购自美国Gibco公司。LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司。EDTA由Augus公司提供。Hoechst 33258、SRB由Sigma公司提供。LDH检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。siRNA由上海吉玛制药技术有限公司提供。其他试剂均为国产分析纯以上产品。 1.3 仪器 单人双面无菌操作台（苏州净化）， 细胞培养箱、低温高速离心机（美国Thermo）， 荧光显微镜（带数码相机）、倒置显微镜（德国Leica）， 酶标仪（美国BioRad）等。 2 方法 2.1 原代大鼠神经元的分离与培养［4］ 预先用多聚赖氨酸包被培养皿6 h以上，吸出多聚赖氨酸，风干2 h，备用。取SD大鼠乳鼠（出生1～3 d），体积分数为75%的酒精消毒，断头开颅，去脑膜，取大脑皮层神经元，放进Kreb’s解剖液（保持低温），剪碎至大约0.5 mm2，成沙泥状，用Kreb’s解剖液冲洗2～3次，0.25％的胰酶消化10 min，重复消化2～3次，将每次的消化液放入带血清的DMEM中终止消化，将细胞悬液适量吹打70～100次以分散细胞,过筛（180目），1 500 r/min离心5～8 min，去上清，再加入DMEM培养液重悬细胞，细胞计数并调整细胞数使其到2.0～2.5×105个/mL, 将其接种到预先涂以多聚赖氨酸的培养皿中。在37 ℃、5%CO2条件下培养, 培养1 d，细胞贴壁后，换液去除死细胞。在48 h后，加入胶质细胞抑制阿糖胞苷，每3天换液1次，培养1个星期，可做实验。 2.2 体外细胞缺氧模型的制备［5］ 用培养了1个星期的细胞置密闭容器中，真空泵抽空，继续保持抽取30 min至抽完培养基中溶解氧，然后缓慢充入95％N2及5％CO2恢复到正常气压（在密闭容器中放一气囊指示装置），置37 ℃培养箱培养1、2、4、8、12、24 h。用Hoechst 33258［6］ 、LDH和SRB［7］判断细胞凋亡情况。 2.3 用