利用siRNA对β细胞上胰岛素受体的抑制作用论文.docVIP

　　利用siRNA对β细胞上胰岛素受体的抑制作用论文 【摘要】 目的： 利用siRNA抑制β TC3细胞中胰岛素受体基因的表达. 方法： 化学合成胰岛素受体（IR）基因的4对特异siRNAs（实验组:siRNA1组,siRNA2组,siRNA3组,siRNA4组）和1对非特异siRNA（NC组）. 通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染β TC3细胞,24 h后荧光显微镜下观察不同浓度siRNA转染细胞的效率；应用逆转录PCR检测IR mRNA表达. 结果： ① 50，100，150，200 nmol/L siRNA转染β TC3细胞24 h后,转染效率分别为（73.1±4.1）%，（92.9±3.4）%，（90.8±4.0）%，（93.9±2.8）%，选择100 nmol/L浓度作为siRNA转染浓度. ② 转染100 nmol/L siRNAs 24 h后.freelRNA表达都有不同程度下调, 其中以siRNA2组抑制效果最为明显，表达减少了70.5%. 结论： 靶向IR mRNA的siRNA能在体外特异性的抑制IR的表达，为进一步研究β细胞上IR 的功能提供了实验基础. 【关键词】 受体，胰岛素； RNA， 小分子干扰； RNA干扰；转染 0引言 胰岛素受体（insulin receptor, IR）编码基因突变可直接导致胰岛素作用的降低，IR基因及蛋白表达量下调或IR降解增加可导致胰岛素分泌障碍［1］. 有研究［2-3］表明β细胞上有IR和4种胰岛素受体底物蛋白（IRS）1,2,3,4及其下游的转导蛋白表达. β细胞中的胰岛素信号转导蛋白可以被葡萄糖或直接被胰岛素刺激所活化，β细胞也是胰岛素作用的靶细胞［4］. 但是通过RNA干扰技术阻断β细胞上IR后对2型糖尿病发病机制的相关研究还较少. 我们利用RNA干扰技术，以IR基因为靶点，设计了4条小干涉RNA(siRNA)，期待找到可以明显干扰β细胞上IR表达的siRNA片段，为进一步探讨β细胞上IR在2型糖尿病发病机制中的作用提供实验基础. 1材料和方法 1.1材料细胞培养基RPMI1640（美国Gibco公司）；胰蛋白酶，Trizol和脂质体转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；反转录相关试剂（Fermentas公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京天为时代科技有限公司）；PCR扩增引物由上海捷瑞生物有限公司合成. IR引物：上游引物，5′GAA GAT CAC CCT TCT TCG AG3′；下游引物，5′CAG TGA GTC TCT CTG GAC AG3′，扩增产物为737 bp. GAPDH引物：上游引物，5′AAT TCA ACG GCA CAG TCA AGG C3′；下游引物，5′GGA TGC AGG GAT GAT GTT CTG G 3′，扩增产物467 bp. 1.2方法 1.2.1siRNA的设计、合成与配制根据GenBank获得小鼠IR基因（GenBank登录号：NM_010568）的cDNA序列，从Ambion公司提供的网上设计工具siRNA Design Tools （.ambion.corn/teehlib/mise/siRNAtols.html）参照siRNA设计原则［5］挑选4条特异性寡核苷酸序列作为靶序列（Target Sequence, TS），分别为：TS1 5′GAG GCT GCA CTG TGA TCA A3′；TS2 5′AGA TTA TCT TAA AGT GGA A3′；TS3 5′GGA CCA TGC CTG AAG CTA A3′；TS4 5′GGA TCG AGT TCC TCA ATG A3′，并进行全基因组扫描（BLAST）和序列同源分析（通过NCBI提供的基因组数据库和分析软件进行），确保选择的siRNA序列与基因组中其他基因无明显同源性. siRNA目的序列委托上海吉码生物有限公司合成，并同时合成与IR基因序列无关的siRNA作为阴性对照（negative contro1, NC），阴性对照正义链的5′端有FAM荧光标记. 合成序列如下： siRNA1正义链：5′GAG GCU GCA CUG UGA UCA AdTdT3′，反义链：5′UUG AUC ACA GUG CAG CCU CdGdG3′；siRNA2正义链：5′AGA UUA UCU UAA AGU GGA AdTdT3′，反义链：5′UUC CAC UUU AAG AUA AUC UdGdA3′；siRNA3正义链：5′GGA CCA UGC CU