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　　利用siRNA抑制HER2表达的研究论文 【关键词】 siRNA The Inhibition of HER2 Expression by siRNA Abstract：Objective To inhibit the expression of HER2 gene in MCF7 human breast carcinoma cells by siRNA. Methods Five siRNAs targeting HER2 ed into MCF7 cells. After selection, the stable transfected cells RNA abundance in the stable transfected cells etry (FCM). The stable transfected cells ice, and the HER2 protein expression in transplant tumor munohistochemical method. Results siRNA 3P could effectively decrease the HER2 mRNA expression in MCF7 cells. The FCM data shoorigenesis of MCF7 cells in nude mice. Correspondingly, the HER2 protein expression in transplant tumors RNA could effectively inhibit HER2 expression in vivo and in vitro, and all interfering RNA (siRNA); Breast cancer 摘要：目的 利用siRNA抑制人乳腺癌MCF7细胞中HER2基因的表达。方法 针对HER2 mRNA设计了5条siRNA，并构建相应的表达质粒，将质粒转染MCF7乳腺癌细胞，筛选稳定表达株，利用RTPCR分析siRNA对细胞中HER2 mRNA的降解作用；利用流式细胞术分析细胞表面HER2蛋白的表达；利用裸鼠进行体内成瘤性实验，用免疫组化法检测瘤组织中HER2的表达。结果 siRNA 3P能明显降低MCF7细胞中HER2 mRNA的丰度；流式细胞分析表明，其中siRNA 2P 和3P稳定转染的MCF7细胞表面HER2的表达明显降低；五种表达不同siRNA的MCF7细胞在裸鼠体内的成瘤性均有所降低，并且瘤组织中HER2蛋白的表达也明显减少。结论 靶向HER2 mRNA 的siRNA能在体内外有效抑制HER2的表达.freelall interfering RNA, siRNA），并从细胞及实验动物水平，观察了siRNA对HER2表达的特异性抑制作用，探讨siRNA作为肿瘤基因治疗的可行性和特异性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株 人乳腺腺癌MCF7细胞株由本室保存，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基、37℃、5%CO2孵箱中培养。 1.1.2 质粒 pSilencerTM 2.1U6 hygro siRNA表达载体购自Ambion公司。 1.1.3 试剂 胎牛血清、RPMI1640培养基为GIBCOBRL产品；限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ，T4连接酶，Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，逆转录酶MMLV购自Promega公司；Trizol试剂，转染试剂Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品；Hygromycin B购自Roche公司；HER2小鼠抗人单克隆抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自中山公司。 1.1.4 实验动物 4～6周龄雌性BALB/c裸鼠购自中国医学科学院动物研究所。 1.2 方法 1.2.1 发夹siRNA转录模板的设计 发夹siRNA转录模板的结构如图1所示。siRNA的靶序列长度为19nt，两个反向互补排列的19nt特异性序列由一个9nt的Loop相连接，形成茎环结构。转录模板两端分别为BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。人HER2的mRNA基因序列从GenBank获得，序列号为NM_004448，利用程序siRNA DNA Designer 1.3设计针对HER2的siRNA，从中选择5段19nt的特异性靶序列，分别合成5条发夹siRNA转录模板，见表1。 1.2.2 质粒构建 将合成的5条siRNA转录模板序列退火后，连入线性化载体pSilencerT