原位杂交法检测视网膜色素上皮细胞炎前因子mRNA的表达论文.docVIP

　　原位杂交法检测视网膜色素上皮细胞炎前因子mRNA的表达论文 .freelRNA 摘要:目的观察视网膜色素上皮细胞（RPE）在炎性介质刺激下炎前因子mRNA的表达.方法培养的人RPE经IL-1β（10μg L-1）和脂多糖（1mg L-1）的刺激后，用生物素标记的寡核苷酸探针进行原位杂交，检测RPE炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA表达.杂交结果使用图像分析法进行比较.结果原位杂交显示RPE细胞质中均呈现浓淡不一的淡蓝色着色，胞核不着色.其中IL-6mRNA在脂多糖刺激下染色较浅，增加脂多糖的剂量不能提高其表达.图像分析显示在IL-1β（10μg L-1）和脂多糖（1mg L-1）刺激下，RPE表达IL-6mRNA的吸光度分别为108±18和35±14.freelRNA. Keyentepithelium;retina;insituhy-bridization;proinflammatoryfactors;mRNA Abstract:AIMTodetermineentepi-thelium（RPE）expressesproinflammatoryfactorsmessengerRNA（mRNA）inculturedRPEcellsstimulatedbyinflam-matoryfactors.METHODSCulturedRPEtreatedg L-1）odels.ThepresenceofmRNAcodingforIL-1β，IL-6，IL-8andTNFαageanalysisedtodeterminestainingdifferencesbe-tRNApositivecellsshoafterbeingstimulatedRNAshoRNAexpression.ImageanalysisshoRNAexpressionu-latedRNAencodingforIL-1β，IL-6，IL-8andTNF-αiseffectivelydetectedbyISHinculturedhumanRPEstimulatedmatoryfactors. 0引言 增生性玻璃体视网膜病变（proliferativevitreoretinopathy，PVR）是常见的致盲性眼病之一，其发病的分子机制是目前眼底病研究的热点［1-3］.临床研究发现许多炎前因子mRNA和蛋白质在PVR膜中不同程度的表达，与PVR的发生明显相关，其中IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α在玻璃体切割液和PVR膜中水平较高［4-8］.视网膜色素上皮细胞（reti-nalpigmentepithelium，RPE）是PVR膜中的主要细胞成分，RPE细胞移行、增殖和分泌胶原在PVR形成中可能起重要的作用［1-8］.我们用原位杂交法观察培养RPE在炎性介质作用下炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA的表达，以明确RPE是否表达炎前因子的mRNA，从而进一步了解PVR发生的分子机制. 1材料和方法 1.1材料第3代RPE细胞由王雨生副教授惠增，培养条件为37℃，50mL L-1CO2，用含100mL L-1血清的DMEM培养.对近融合期细胞以2.5g L-1胰蛋白酶消化进行传代.选6～8代细胞用于实验.细胞培养主要试剂有:DMEM培养基（Gibco产品）、胰蛋白酶（Sigma产品）和小牛血清（杭州四季青产品）.将18mm×18mm的盖玻片分成4小块，高温高压消毒后多聚赖氨酸包被.无菌玻片平铺于直径10cm的培养皿中，将200μL密度为4×104mL -1RPE悬液滴于的盖玻片中央，培养4h后补足培养液.细胞将近铺满时捞出玻片.终止培养前6h加入脂多糖（lipolysaccharride，LPS）1mg L-1，或者IL-1β10μg L-1.切片用PBS漂洗3次，40g L-1多聚甲醛固定1～2h干燥后-20℃保存. 1.2方法 1.2.1培养细胞的鉴定取细胞铺片采用SABC法，进行抗人角蛋白免疫组织化学染色.鼠抗人细胞角蛋白单抗系Dako产品;SABC试剂盒为博士德生物工程公司产品. 1.2.2杂交探针生物素标记IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α寡核苷酸探针产自上海基康生物技术公司，探针序列分别为IL-1β:5’-TCATCCTCATTGCCACTGTAATAAGCCATC-3’;IL-6:5’-CTCACTACTCTCAAATCTGTTCTGGAGGTA-3’;IL-8:5’-GTTGGCGCAGTGTGGTCCACTCTCAATCAC-3’;TNF-α:5’-GCTGGGCTCCGTGTCTCAAGGAAGTCTGGA-3’［8-10］.3