RT-PCR的具体步骤.docxVIP

RT-PCR实验步骤 一．实验器具： 1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头：1ml、200μl、20μl 3.匀浆管：5ml 4.EP管：1.5ml、500μl、200μl 5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml 8.试管架：5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒：1-2个 10.大瓷缸：1个 11.锡泊纸：一卷 12.卷纸：2卷 13.三角烧瓶：带盖，稍大 二．实验器具处理 1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。 2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。 3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。 三．试剂配制 1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。 2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。 3．异丙醇：放入棕色瓶中。 4．氯仿：放入棕色瓶中。 5．琼脂糖 四．缓冲液配制 1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度) 2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油 五．琼脂糖凝胶配制 1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼 脂糖凝固)后现进行电泳。 2．1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g 六．需购置材料 Taq酶(-20度保存)(配10×buffer和MgCl2)：不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。个人感觉天为时代的普通Taq酶就很不错。 dNTP(4度保存)：向生物公司购买，原装和分装均可。 oligo(dT)15(-20度保存)：可以向生物公司购买Invitrogen合成的廉价货，每支10元，稀释后使用(注意稀释浓度)，也可以购买Promega的原装货，稀释10倍后使用，稀释液4度保存。 M-MLV(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，当然有钱可以购买更好的AMV。 RNasin(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，原装分装均可。 DEPC(4度保存)：向生物公司购买，5克足矣。 Trizol(4度保存)：有50ml和100ml规格，按照实验需要自己购买。国外进口的有Invitrogen(Trizol)、罗氏(Tri Pure)、MRC(Tri Reagent)；国内的也行，天为时代的就不错。 Marker(4度保存)：按照目的条带大小购买，推荐使用天为时代的Marker(物美价廉，上样2.5ul就很亮了，较3.0ul的Takara同样品种Marker为亮)，本人很喜欢它的DL2000。 电泳Loading Buffer(4度保存)：按照配方自己配制，不需要购买(购买的话价格挺贵)。 七．引物合成 1．内参照：GAPDH(452bp) 正义：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 反义：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 2．退火温度计算：2(A+T)+4(G+C)，正反义平均数，再上下波动4-5度。 3．引物2 OD已足够，每管1 OD分装。 4．引物稀释：加DEPC水量(μl)＝ X nmol/OD(合成的引物管上有标注) × 管上所标OD数(推荐每管引物为1 OD分装，合成之前向公司说明这一点，切记！！)×100。最终引物浓度为10pmol /μl。 八．PCR产物电泳 取1-10μl(一般取5μl)PCR产物，加已点在纸上的6×上样缓冲液，反复吸打混匀后进行电泳，一般用稳压状