双菌株协同发酵提高红景天中苷和酪醇含量的研究论文.docVIP

　　双菌株协同发酵提高红景天中苷和酪醇含量的研究论文 宋伟舟，孙剑峰，刘玉应， 冯敏， 蒋春，邓小晨 【摘要】 目的从已分离的具有红景天苷转化能力的霉菌中，筛选能协同发酵红景天苷的双菌株组合。方法以重氮盐比色法初步确定菌株组合和双菌株协同主要发酵条件，并用高效液相色谱(HPLC)法复筛。结果选出的最优双菌株组合编号为35-42.freels植物的根及根茎［1］，我国红景天资源大多分布在高寒地区。其有效成分主要是红景天苷及其苷元-酪醇，二者均具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等作用。红景天制品是抗高原反应的必备品。随着红景天产品广泛开发和应用，过度采挖使天然资源日趋枯竭［2］，对高原藏区生态环境的破坏严重。因此，保护性开发野生资源，提高红景天有效利用率显得更加重要。在其他一些植物药材中，苷是从无活性的苷元脱去糖基获得的，可以采用酸解或酶法来水解糖基，简便易行。与之不同，红景天苷和苷元生成是合成代谢，其前体来源不太清楚，从而造成提高其有效成分研究的难度。目前已有的研究主要包括：添加前体物和酶催化剂合成红景天苷、化学合成法［3］、植物细胞组织培养和基因克隆等方法［4,.freels。菌种：本实验室保存，除2号为米曲霉外，其余菌株均为黑曲霉。 培养基：红景天发酵培养基：红景天粉与水以1∶10的比例。固体种子培养基：麸皮∶水=1∶1。液体种子培养基：麸皮∶水=1∶5，煮沸20 min，过滤，取滤液，加MgSO4 0.05%， KH2PO5 0.1%，(NH4)2SO4 0.1%。试剂：酪醇标准品、红景天苷标准品均购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。 2 方法 2.1 培养方法 2.1.1 孢子悬液制备将菌株接种于固体种子培养基，30℃培养48 h，加水洗下孢子，稀释至孢子浓度约108个/ml。 2.1.2 菌丝体制备按0.1%接种量将孢子悬液接入液体种子培养基，30℃，200 r/min，时间48 h。 2.1.3 红景天发酵培养30℃，200 r/min，时间为2～4 d。 2.2 提取方法红景天发酵液用75%的乙醇按照1∶8的比例分别提取3次，合并滤液，得到发酵提取液，用于重氮盐比色法测定和HPLC检测。 2.3 测定方法 2.3.1 重氮盐比色法［6］取发酵提取液5 ml，加入10%的醋酸铅5 ml和饱和硫酸钠2 ml，定容至25 ml，沉淀、离心，取上清液5 ml于20 ml比色管中，其中加2%碳酸钠3 ml及重氮化试剂3 ml，摇匀显色5 min，再加5%氢氧化钠0.5 ml，显色15 min，整个过程在4℃以下进行，稀释10倍，在489 nm波长下测定吸光度。以吸光度高低作为总有效成分（苷和酪醇的总量）的初筛指标。 2.3.2 HPLC检测［7］色谱条件：岛津LC-6A 高效液相色谱仪；色谱柱为Y-C18(10u)200 nm×4.6 mm；流动相为V（甲醇）：V（高水）=25∶75 ；检测波长275 nm；自然pH；柱温为室温；进样量：20 μl；流速1.0 ml·min-1。精密称取红景天苷、酪醇标准品25.00 mg，分别置于25 ml的容量瓶中，无水乙醇溶解定容，制成浓度为1.00 mg·ml-1的标准品，取苷标准品溶液进样2，4，6，8，10，12 μl，酪醇标准品溶液进样1，2，3，4，5，6 μl，测定峰面积，以峰面积（Y）与对照液中红景天苷和酪醇的质量（X/μg）作回归计算，得到标准曲线。发酵产物中红景天苷和酪醇的含量测定按以上条件进行。 3 结果 3.1 双菌株初筛在本研究前期的菌株筛选工作中，已对重氮盐比色法和HPLC进行对比测定，证明重氮盐比色法测定红景天总有效成分的结果，与HPLC测定值有较好的相关性（另文发表）。从已分离到的微生物中，选出发酵能力较高的8株霉菌，两两组合，接种于红景天发酵培养基中进行混合菌株发酵，并与单菌株发酵比较。结果见表1和图1。表1 双菌株发酵红景天总有效成分测定（略） 由表1及图1可以看出，22种双菌株组合中，83.33%的高于对照，22.72%高于单菌株发酵，其中有4对组合高于对照170%以上（高于单菌株发酵29.27%以上）。 3.2 双菌株复筛以峰面积（Y）与对照液中红景天苷的量（X/μg）作回归计算，结果表明红景天苷含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y= 7 684 080.042 9X+ 64 169.261 9，r=0.999 7（n=6）；以峰面积（Y）与对照液中酪醇的量（X/μg）作回归计算，结果表明酪醇含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1 180 000X-7 624.23，r=0.999 8（n=6）。将初筛中有效成分最高的7个双菌株组合，接种