八氯二丙醚对体外培养CHL细胞DNA合成影响论文.docVIP

　　八氯二丙醚对体外培养CHL细胞DNA合成影响论文 【摘要】 目的 研究八氯二丙醚对体外培养中国仓鼠肺细胞(CHL)DNA合成影响。方法 采用DNA荧光定量测定方法,观察不同染毒浓度(0250，0187，0125，0062，0046，0031μg/ml)对CHL细胞DNA合成影响。结果 八氯二丙醚浓度为0062，0046μg/ml时DNA合成量与对照组比差异有统计学意义，表现为合成增加(P 005).freell时，则表现为合成抑制(P 005)，且呈剂量-反应关系(P 005)；0250μg/ml浓度在脱离染毒后2，4，6，12h内DNA合成量持续下降。结论 在低浓度时(0062，0046μg/ml)，八氯二丙醚可引起CHL细胞DNA合成能力增加,而在高浓度时(0250，0187，0125μg/ml)则表现为DNA合成抑制，且这种抑制由DNA损伤引起。 【关键词】 八氯二丙醚 八氯二丙醚(Octachlorodipropyl ether，S2)化学名为2，3，3，3，2，3，3，3－八氯二丙醚。S2作为农药的增效剂，可以明显提高拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类药物的杀虫效果〔1〕。已有研究表明，体外实验中S2为可疑致突变物，并且体外可直接导致小牛胸腺DNA交联率增加〔2-5〕。体内实验表明，S2蚊香烟雾对小鼠肺细胞和睾丸细胞的DNA合成有抑制作用〔6〕。本文采用DNA荧光定量测定方法，观察S2不同染毒浓度对CHL细胞DNA合成影响，以进一步探讨其遗传毒性。 1 材料与方法 11 材料 111 仪器 荧光分光光度计(美国Crary eslipse公司)；低温冷冻离心机(美国Sigma公司)；水浴锅、涡旋器。 112 试剂 八氯二丙醚(江都恒生化工有限公司),纯度 93%，分子量3770，比重162，杂质含量，H2SO4 01%,HCl 005%；Hoechst33258荧光染料,小牛胸腺DNA(美国Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。 113 细胞株及培养条件 中国仓鼠肺细胞株(CHL)(江苏省药物检验所)，用含10%新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、100U青霉素、谷氨酰胺的RPMI1640培养基(GIBCO),于37℃、5%CO2培养箱中培养、传代,取生长良好的细胞用于实验。 12 方法 121 S2对CHL细胞的半数致死浓度(IC50)实验 在96孔培养板上接种CHL细胞，每孔100μl，接种密度为1×105/孔，培养24h后每孔加入不同浓度的S2溶液，各剂量组终浓度分别为0，1，2，4，8，32，64μg/ml，每个剂量组设定6个平行孔。染毒24h后弃去每孔中的培养液，加入含10%四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)5mg/ml的RPMI1640培养液(不含小牛血清)，继续培养4h后，弃去MTT溶液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μl后用酶标仪测定各孔在570nm波长处的吸光度(A)值。Bliss法计算IC50,并测得细胞存活率＞95%的S2浓度。 122 S2对CHL细胞DNA合成影响的测定 取生长良好的细胞接种于24孔培养板，每孔2ml，接种密度为07×106/孔,培养24h后每孔加入不同浓度的S2溶液，溶剂对照组浓度分别为0031，0046，0062，0187，0250μg/ml，每个剂量组设定6个平行孔,染毒24h后，参照Domas TR等〔7〕,Brunk CF等〔8〕方法及陆瑛等〔9〕介绍的方法改进,测定每组的DNA含量。其方法为在每一测量样本中加入荧光缓冲剂(No33258),.freel,发射波长为458nm。对照参数为小牛胸腺DNA的标准曲线。 13 统计分析 采用SAS 801软件进行方差分析及Duntt检验。 2 结果 21 S2对CHL细胞的IC50测定结果 由于S2难溶于水，为配成准确的浓度系列，我们采用少量的乙醇作为溶剂，为此先对乙醇的毒性进行测定。结果表明，当乙醇浓度≤04%时,细胞的生长不随其含量增加而变化,通过对各浓度组之间的A570值进行比较,差异无统计学意义(P 005)。当乙醇浓度＞04%时,细胞的A570值降低,差异均有统计学意义(P 005)，故进行IC50及DNA合成影响的测定时使用的乙醇浓度 04%，用Bliss法求得S2的IC50为5478μg/ml，95%CI=4277～7015μg/ml，细胞存活率＞95%的最高S2浓度为05μg/ml(表1)。 表1 S2的IC50测定结果（略） 22 S2对CHL细胞DNA合成影响的测定 221 DNA浓度与荧光强度关系的标准曲线(表2) 结果表明，DNA含量在2424～8358