实验室常用液体配制标准操作规程重点讲义.doc

常用液体配制标准操作规程（SOP） 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 二〇〇八年九月修订 目录 一、细菌培养系统 二、DNA操作系统三、蛋白质操作系统、单克隆抗体制备系统LB培养基: 每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。 固体培养基: LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。 5、挑ER2738菌单克隆，接种于4mlTet抗性的LB中，于37℃ 190rpm过夜振荡培养。 2）感受态制备： 1、取前一夜扩增的菌液3ml接种于 250mlTet抗性LB中，37℃ 240rpm振荡培养，约2-3小时OD值可达0.6(其间每1小时测一次OD，其值在0.4-0.8之间均可，但在0.6时效率最好)； 2、将菌液置于冰水混合物中冷浴30分钟。同时将前一夜置于4℃保存的物品取出，置于冰水混合物中冷浴30分钟，同时将离心机预冷到4℃； 3、将菌液全部转入500ml离心管中，2500rpm，4℃离心10分钟； 4、弃上清，向离心管中加入约100ml预冷的无菌水，在冰水混合物中摇晃瓶身，使沉淀充分悬起，然后再补加200ml无菌水，与离心机中4000rpm，4℃ 下离心10分钟； 5、重复步骤4两次； 6、以10%甘油代替无菌水重复步骤4一次；在离心的过程中将离心管插入冰中预冷； 7、充分弃上清，加入200ul10%甘油，要换瓶身，使沉淀充分悬起，用预冷的枪头按100ul/支分装细胞于离心管中； 8、将分装好的细胞放入-80℃保存。 3）质量控制： 将电转杯从乙醇中取出，置于超净台中，用无菌风吹4小时 从-80℃取出一支感受态，立即放入冰盒里； 取1ul标准质粒（1ug/ml）加入感受态中，混匀后，加入预冷的电转杯中； 将电转条件设为2.5，电击2-3秒，立即加入1mlSOC培养基并混匀； 将混合物转入1.5ml离心管中于37℃，200rpm振荡恢复半小时； 用LB将培养物稀释至103涂于Amp固体培养基上，倒置于37℃温箱中，过夜培养。 计算效率：效率=菌落数×103×103。 二、DNA操作系统 1、溶液 I: 葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH8.0。 溶液 II: NaOH 0.2mol/L，SDS 1%，用ddH2O现配现用。 溶液 Ⅲ: 取5mol/L NaAc 60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至100mL。 酚-氯仿-异戊醇(25:24:1) 以25：24：1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。 TE缓冲液: 10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，灭菌后使用。实验室中配有100×的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1×使用液，灭菌后使用。0.1mol/L CaCl2: 在适量纯水中溶解54g CaCl2.6H2O，定容至100mL，高压除菌后保存于4℃备用。将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。补加水至终体积为100ml。0.45μm孔径查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。 注意丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。 0%SDS 900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节pH值至7.2加水定容至L，分装备用。 10％过硫酸铵 称取过硫酸铵2适量水溶解后定容至20m，分装成1m/管于20℃保存备用 7、蛋白质电泳buffer（5×） 称取三羟甲基氨基甲烷15.1g、甘氨酸94.0g、十二烷基硫酸钠5.0g, 在水中溶解并定容至1L。 （二） 染色 1、染色液（考马斯亮蓝染液加考马斯亮蓝R-250或G-250至0.25%，过滤后使用C6H8O7·3H2O,加水定容至1 L。 （三） 杂交 1、电转液：称取Tris－Base 18.2g，甘氨酸86.5g，先加4L水溶解，再加甲醇1200ml, 定容至6L。 2、10×TN：称取NaCl 438.3g, Tris 60.57g, 加入浓盐酸调节至PH 8.0，定容至5L 。 3、封闭液（WB用）： 称取5g 脱脂奶粉，加入TN，定容至100ml。 4、TNT：TN中加 Tween-20至0.05%。 50mmol/LTris-HCl（pH7.2），0mmol/LEDTA，00mmol/LN