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山东花生腐霉根腐病病原鉴定 摘要：利用组织分离技术和选择性培养基纯化技术对山东地区花生腐霉根腐病的病原菌进行了分离和纯化。按照柯赫法则，根据余永年真菌形态学鉴定方法及利用ITS序列比对等分子生物学方法对病原菌进行了鉴定。结果表明，引起山东地区花生腐霉根腐病的病原菌为群结腐霉（Pythium myriotylum Drechsler）、旋柄腐霉（Pythium helicoides Drechsler）、畸雌腐霉（Pythium irregulare Buisman）以及终极腐霉（Pythium ultimum Trow）。 Identification of Peanut Pythium Root Rot Pathogen in Shandong Abstract：Pathogen of peanut Pythium root rot pathogen in Shandong was isolated and purified by techniques of tissue isolation and selective media. Based on Koch’s rule,the pathogen was identified.by the methods of Fungal morphological and ITS sequence alignment. And it indicated that the pathogen of peanut Pythium root rot pathogen in Shandong was Pythium myriotylum Drechsler、Pythium helicoides Drechsler、Pythium irregulare Buisman and Pythium ultimum Trow. Key words: peanut; Pythium; root rot; identification 近年来,随着种植花生经济效益的不断提高,山东省的花生种植面积也在不断增长，目前主要划分的两大优势区域，一是以种植春花生为主的胶东半岛、鲁中和鲁东南地区的29个县；二是以种植夏花生为主的鲁西和鲁西南地区黄河故道的5个县。其中花生腐霉根腐病是影响山东花生产量的主要因素之一，由于种植面积大，产区集中，连作面积广，给花生生产造成了很大危害。花生根部病害调查分离时，我们从以上大部分地区的花生病株中分离到了腐霉菌（Pythium sp），为了明确山东省花生腐霉根腐病的病原特征及生物学特性，为防治提供依据，作者于2007-2009年度对山东花生腐霉根腐病病原进行了研究,结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 症状表现调查[1]。 1.2 病原菌分离与纯化,用吸水纸吸干表面的水珠,将病株须根系剪成长5mm 的小块,将其放置于VP3 选择性培养基中[2] 25℃培养。24h后不断观察，发现有腐霉长出立即转移到CMA培养基上放在25℃恒温箱中培养，纯化，转入CMA斜面培养，5d后菌丝长满，放入4℃冰箱保存备用。 1.3 病原菌致病性测定[3]，采用盆栽接种测定方法测定病原菌的致病性，将土壤灭菌后装花盆，种花生(花育22)，花生团棵后，把4℃保存的菌种在CMA培养基上25℃扩繁，长满菌丝后按4%（菌：土）的接种量，与花盆内的土壤混匀，保湿筒保湿48h后调查发病情况，调查持续一周，从病组织分离回接菌种，并作单菌丝培养。 1.4 病原菌种类鉴定1.4.1 病原菌最适温度及pH值测定 PDA培养基制成平板。将事先培养好的直径5mm的病菌圆饼转接在平板中央，分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃进行病原菌最适生长温度测定。在将PDA培养基的pH值调至3-12，按照上述方法将接好菌饼的培养皿置于25℃恒温培养箱内培养，定期观察，记录菌落生长速率以及菌落形态特征。 1.4.2 病原菌形态观察 CMA平板培养基上培养，3d后移取边缘菌丝至皮氏（Petri）培养液中，25℃培养1～3d挑取孢子囊，观察孢子囊形态，有无层出现象，游动孢子的游出方式，并且测量孢子囊大小。待出现藏卵器、雄器、卵孢子后，观察藏卵器、雄器的形态，着生位置，配合情况及卵孢子的形态特征，每项指标分别观察测量100个，并且测量其大小，计算平均值[4]。 鉴定则依据孢子囊、藏卵器、雄器、卵孢子的形态特征，大小及其特性来鉴定，主要参考《中国真菌志》（第六卷，科学出版社，余永年主编）进行鉴定[5]。 1.4.3 病原菌ITS序列测定CMA平板培养好的病原菌的菌落刮取下来，利用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，而后利用通用引物(ITS1、 ITS4)进行PCR扩增，最后利用Biospin胶回收试剂盒进行回收并