中华鳖养殖中芽孢杆菌、嗜水气单胞菌及其噬菌体的分离和性质研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 目前，我国中华鳖主要采用集约化养殖方式，高密度的控温养殖带来很好的经济效 益，但残饵以及排泄物的积累也使得水质恶化，微生态环境失调，极易爆发中华鳖疾病。 目前人们多采取药物投放、饲料添加抗生素以及施加微生态制剂的方式来调节水质、预 防与治疗疾病的爆发，其中微生态制剂以无污染、生态环保等优点受到人们亲睐。芽孢 杆菌是微生态制剂的常用菌之一，在净化水质方面具有很好的作用，但在其生产过程中 曾发生过噬菌体污染造成很大损失。除此之外，噬菌体治疗是一种针对细菌性疾病非常 有发展前景的治疗方式，具有特异性强、不危害有益菌群、无药物残留等特点，已经有 一些学者以小鼠、鸡、猪、虹鳟鱼等生物为对象进行了相关研究并取得了较好的成果， 但到目前为止还未有类似研究以中华鳖为研究对象。本实验以中华鳖为实验对象，自其 组织中分离芽孢杆菌并进行菌种鉴定，自养殖水体中分离芽孢杆菌以及常见致病菌嗜水 气单胞菌的噬菌体并进行性质研究，初步探讨芽孢杆菌噬菌体污染的预防措施以及中华 鳖细菌性疾病的噬菌体治疗，实验结果如下： 1 自中华鳖肠道组织中分离出3 株芽孢杆菌，经菌落及菌体形态、主要生理生化特 征鉴定及 16S rDNA 序列分析，其中一株菌被鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) ，另 外 2 株菌为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis) 。 2 以所分离短小芽孢杆菌为指示菌，从中华鳖养殖水体中分离得到其噬菌体。该噬 菌体具有较高的热稳定性和较广的 pH 适应范围，可在 pH4~9 范围内生长繁殖，也可在 80 ℃以下的环境中存活，但对 80 ℃以上的高温敏感，对紫外线照射也比较敏感，照射 时间超过 6 min 噬菌体全部失活；与宿主的吸附时间不超过 5 min；最佳感染复数(MOI) 为 0.001 ；一步生长曲线结果表明，该噬菌体感染宿主菌的潜伏时间为 10 min，爆发时 间为 70 min，裂解量约为 94.25，潜伏期短、裂解量大，具有较强的“毒性”。 3 以水产养殖常见致病菌——嗜水气单胞菌为宿主菌，自中华鳖养殖水体分离相应 噬菌体，并对噬菌体性质及其与宿主的动态关系等进行研究分析，为噬菌体疗法在中华 鳖养殖中的应用奠定基础。结果表明分离的的噬菌体为裂解性噬菌体，噬菌斑透明、边 缘整齐。该噬菌体对 pH 具有较广的适用范围，但对酸性环境比较敏感，pH5 时几乎无 噬菌斑形成；与宿主菌的吸附时间略长，大约为 20 min ；对紫外辐射具有很强的敏感性， I 摘 要 20 s 的紫外照射便使大量的噬菌体死亡，30 s 以上的紫外照射可使噬菌体全部失活；对 高温处理也非常敏感，超过 50 ℃时，仅低稀释倍数的双层平板上有 1~3 个噬菌斑形成。 最佳感染复数的实验结果显示，当 MOI=0.1 时，噬菌体滴度最高，而当MOI=0.001 时， 噬菌体滴度最低；一步生长曲线结果显示，噬菌体的潜伏时间约为 50 min，爆发时间仅 为 40 min ，对嗜水气单胞菌的裂解量约为 92.8，裂解能力高。噬菌体与其宿主菌的动态 关系研究结果表明，添加适当浓度的噬菌体可以有效降低嗜水气单胞菌的浓度，并使其 维持在较低的浓度下形成动态平衡，达不到引发疾病的危险浓度范围，而噬菌体的浓度 在添加之后仅有小幅度的变化。 总体来说，短小芽孢杆菌噬菌体对宿主菌侵染能力强，但对紫外照射、高温处理比 较敏感，可采用紫外、高温等方法消灭噬菌体，避免噬菌体污染；嗜水气单胞菌噬菌体 侵染宿主菌的爆发时间短，裂解量大，能有效降低嗜水气单胞菌的浓度，但对生长条件 略微苛刻，环境过酸、紫外照射、温度过高均可能使其失活，这是开展噬菌体治疗时应 当注意的问题。 关键词 中华鳖 芽孢杆菌 嗜水气单胞菌 噬菌体 细菌鉴定 II Abstract A