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BIOCHEM AND MICROBIOEGN 生物技术大实验 实 验 指 导 书 指导教师：王志刚 王昌河 齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院 序 言 随着国家经济社会及教育改革的发展，现有的人才培养模式不能满足当今社会对综合型、应用型及创新型人才培养的需求，教学内容和课程体系改革是人才培养模式改革的主要落脚点，教学方法和教学手段是实现教学目标、落实人才培养模式、提高素质教育的重要因素，而实验教学水平和实验教学层次则直接影响到学生的知识水平、专业技能和综合素质的提升。 生物技术大实验打破了传统的单一知识点单一实验的作坊式实验教学模式，综合了微生物学、生物化学及生物工程的基本知识和技能，将相关知识点自然有序地贯穿于整个实验教学环节。为生物科学专业开设生物技术大实验是学院进行大胆的创新性尝试，深化本科实验教学改革，突出学生综合应用能力及创新能力的培养，探索并建立多学科交叉融合，具有连续性、综合性和设计性的大实验教学模式，为国家及地方高校进行实验教学的改革和创新提供方法和依据。 生物技术大实验采用集中授课，避免了传统教学方式实验时间分散、学生无法统筹等缺点，更能有效激起学生学习的积极性，提高实验教学效率。菌种的筛选与纯化、菌种培养条件及产酶条件优化、发酵设备的构造及使用、发酵过程的中间分析与控制、发酵浸提液的固液分离与有效成分的初步提取、层析分离和纯化、酶活测定及成品加工等相关技术有机结合，实验过程连贯有序，学生的自主性设计贯穿于实验教学的每个环节，有利于培养学生初步的科研能力，能有效促进学生整体观、综合设计能力及创新能力的培养与提高。 希望通过本实验课程的学习，学生的综合应用能力、实验操作技能及创新能力能有一定的提高，并能有效提高学生初步的科研能力。 实验目录 实验一 枯草芽孢杆菌淀粉酶产生菌的分离与纯化……………………………1 实验二 枯草芽孢杆菌淀粉酶产生菌的发酵条件………………………………7 实验三 发酵浸提液的固液分离及有效成分的初步提取………………………12 实验四 淀粉酶的层析分离和纯化………………………………………………15 实验五 α-淀粉酶的酶活性质研究 ……………………………………………20 附表 ………………………………………………………………………………23 实验一 枯草芽孢杆菌淀粉酶产生菌的分离和纯化 一、目的和要求 1.掌握常用培养基的配制方法、操作步骤及高压蒸汽灭菌的基本原理和方法。 2.掌握微生物的分离、纯化及菌种保藏的基本原理和方法。 3.练习微生物接种、移植和培养等基本技术，掌握无菌操作技术。 4.了解菌种保藏的基本原理，掌握几种常用的菌种保藏方法。 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，混杂生存着大量不同种类的微生物，从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等方法分离、纯化出该微生物，直至得到纯菌株。 需要注意的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不能保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养需要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，这里生活的微生物在数量和种类上都是极其多样的，因此，土壤中的微生物具有较高的丰富度和多样性，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。本实验将采用平板分离法从土壤中分离出α-淀粉酶高产菌的枯草芽孢杆菌。 三、试验材料 1.样品：新鲜土壤 2.培养基 2.1 平板筛选培养基 蛋白胨 10g、NaCl 5g、牛肉膏 3g、可溶性淀粉 20g、0.01％曲利苯蓝 10ml、蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121℃灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。 2.2 斜面培养基 可溶性淀粉 1％、蛋白胨 0.5％、磷酸二氢钾 0.3％、(NH4)2SO4 0.25％，调节PH为7.0，121℃灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。 3.溶液和试剂 新鲜土壤、蒸馏水、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、可溶性淀粉、稀碘液、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液 4.仪器或其它用具 无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、微量移液器、移液器枪头、恒温培养箱、无菌工作台、天平、吸耳球、pH计、量筒、试管、三角瓶、玻璃珠、漏斗、分装架、