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【公告】失败—成功—体味—收获—思考—交流，讲述你我实验中的故事 养细胞难，养原代细胞更难。刚开始做实验时，只是跟在师姐后面看看，传传递递东西。后来自己做，第一次居然养的很好，可能时看多了，步骤都烂熟于心了，当时那个兴奋阿。可是到消化细胞二次接种时，问题来了。做了几次细胞都不贴壁，基本上都漂了。问师姐，我俩的胰酶用量和消化时间都差不多。于是，干脆让师姐帮我消化一次。我看了一眼终止消化前的细胞状态，才恍然大悟：原来师姐在细胞变圆及有部分开始漂时终止消化，而我终止消化时候细胞基本全漂了。操作时间上差的很少，但就是这细微的时间差，细胞可以发生很大改变，细胞的活力受到了影响。后来，我消化细胞时不再看时间，只要镜下改变有了就终止消化，这样接种的细胞在1小时左右就贴的很好了。看来做实验不能按部就班，要从实际出发阿。 最近又是一个失误， ,心痛了好几天啊！ 虽说原因不在自己的操作，但是想起来仍是惭愧啊！我有两株细胞，打算等到状态长得好，数量也足够的时候，冻上以留种，这样心里就会有多多安慰了，有了保证不用担心丢失了。在各种冻存的条件都有的那一天，我很不舒服，浑身没有力气，什么也不想做。一方面，害怕自己万一晕晕糊糊的操作失误或者其他原因导致不可挽回的错误；另一方面，自己确实那天犯懒了。。于是呢，就决定把它们传一下。 结果，第二天一看，几乎全部死光光。呜呜－－ 哭都来不及了没有办法只好面对现实，好好保护剩下的几瓶很少的细胞，等待它再次长起来。寻找原因啊，我可以确定操作没有失误，用的也都是高压后的东西，污染应该不会。再看细胞，那天上午所有处理的细胞无一例外的变得黯淡无光，难道是培养液的问题？ 不可能啊，同样的培养液，额下午用来处理的细胞就安然无恙啊。 再想，－－－，操净台！ 对就是它了。我们实验室有两个操净台，它的紫外的开关有点不正常，有时会有你关了它却仍是开的状态，就算用前你确保它是关闭的，它也会在你用的过程中自动开启,(我已经被照过两次了，好在时间不是很久，胳膊灴了几天才好，现在，每次都把手套与隔离衣紧密连接好才进去）。 而那天一定是我不知道的情况下紫外已经打开，保护好了自己，却伤害了可爱的细胞，......后来一经交流，才知道，我不是第一个碰到这种情况的人。 好在都还有幸存者（那天没有处理的 ），终于今天就可以冻了 。欣慰啊！！总结一下就是：1.只要你是培养细胞，就不要偷懒，哪天该做怎样的处理了，一定要坚持处理，不然，出现的意外，都是始料不及的。2.一定注意不要让紫外与你的细胞亲密接触呵呵，不知朋友们，有没有碰到过，最好没有，希望以后也不会， 这是不是也算是，有时细胞无故状态不好，或者无故身亡的 一个可能原因呢？ 看到这么多细胞培养的前辈们的经验，受益匪浅。本人学细胞培养至今整三个月，培养过三种购买回来的细胞株EC,SMC,SAOS-2,以及从原代培养的HUVEC和rat BMC。谈点自己的感受吧：1、找个高手指点会事半功倍，还要不懂就问，初学者没什么禁忌，不懂很正常的，我是跟着老外学的，刚开始学想问都没法顺利表达那才叫痛苦呢。2、实验器皿，除了移液管和烧杯，其它全为一次性的，虽然花多一点钱，但是培养效果很好，省心省力。还有，我们洗移液管和烧杯，都是4遍自来水冲洗，3遍双蒸水润洗即可。3、灭菌一定要用灭菌指示胶带，不贵，一卷60元正常使用可以用半年，可以区分是否灭菌，方便安全。还有胶带上一定写明日期和姓名，两星期没用应该重新灭菌。4、不管是传代还是原代培养，细胞状态好的时候一定要冻存，这样以后做实验也不会心理没底了。我们的冻存步骤是：加冻存保护液，异丙醇做冻存温度缓冲液，首先置与-70度冰箱两天（最多不能超过一星期），接着转移至液氮冻存，效果良好。5、常用的试剂可以配成高浓度，便于保存。比如trypsin-EDTA，配成10倍浓度后用冻存小瓶分装，每次消化取出一瓶即可。6、如果发现细胞死亡，而未观察到染菌现象，细胞应该继续培养一两天观察。我就有这样的经历，有一次培养的细胞一下子都没了，只有悬浮的一些细胞，以为细胞全死了，但还是换了培养基，结果第二天，换成蓝色滤光片后，惊奇地发现可爱的细胞还好好活着呢，呵呵，幸亏没丢掉。7、每周一三换液，周五传代。传代的时候PBS和trypsin都要先用0.2um的滤膜过滤（不管以前有没有过滤或灭菌，这一步都必须的），如用25cm2的培养瓶，则先用5mlPBS洗两次，用trypsin洗一次后，再加trypsin进行真正的消化，之后加至少与trypsin等量的培养基稀释后离心，1000rpm，5min就行。8、如果能够配一台吸液的设备，如医用的吸痰器＋细颈的滴管，这样在弃去培养瓶或培养板的液体时，效率会极大提高。感想挺多，暂写这些，大家指正。本人在成都，欢迎