为同时催化氧化还原及脱羧反应之双重功能.pdfVIP

肆、討論 蘋果酸 為同時催化氧化還原及脫羧反應之雙重功能 ，其催化過程 為氫負離子之轉移先於脫羧反應之兩連續性反應。目前已知催化過程之詳 細機轉為: 分子上之催化鹼 (general base) 自 L-malate 氫氧基 (β-hydroxyl grop) 接受一個氫質子，將蘋果酸氧化為草醯乙酸 (oxalacetate) 。在此過程中，二價金屬離子使蘋果酸 位處活化中心正確位 置，促進蘋果酸二號碳上氫氧基的極化 (polarization) ，以利氧化還原反應。 隨後二價金屬離子以路易士酸 (Lewis acid) 的方式和草醯乙酸螯合鍵結以 穩定此一中間產物之結構並進行草醯乙酸脫羧反應，產生烯醇式丙酮酸 (enol-pyruvate) 及二氧化碳。 分子上另一個分子作為催化酸 (general acid) 提供氫質子，使烯醇式丙酮酸 (enol-pyruvate) 接受一個氫質子而轉為酮式 丙酮酸 (keto-pyruvate) ，最後釋出NADPH 完成催化。由結構及動力學之研 究已顯示肝鴿蘋果酸 殘基Lys162 於催化過程中應扮演一催化酸之角色， 於氧化脫羧反應提供一氫質子以形成酮式丙酮酸。在人類粒線體蘋果酸 closed form (包含NAD+ 、二價金屬離子錳或鎂、及受質的相似物oxalate) 之結構，殘基Lys183 (相對於肝鴿蘋果酸 殘基Lys162) 位於oxalate C2 的 羧基，被認為可能扮演催化酸的角色 (Yang et al., 2000) 。在其他的氧化脫 羧 isocitrate dehydrogenase Tyr160 Lys230 iso-propylmalate ， 之 與 及 dehydrogenase 之 Tyr 139 與 Lys183 分別作為催化酸 (Lee et al., 1995; 32 Miyazaki et al., 1993) 。各種蘋果酸 Lys162 胺基酸序列之比對 ， 具有高度 ( ) 之保留性 圖四 ，顯示其具有一定之重要性。本論文之目的即在探討鴿肝 細胞漿蘋果酸 殘基Lys162 於催化過程中所扮演之角色並以化學救援法回 復突變型K162A 之活性。 所有之重組鴿肝細胞漿蘋果酸 經由 Q-Sepharose 及 2’,5’-ADP sepharose (或chelating sepharose) 純化後都能在SDS電泳圖上觀察 ( ) K340A 到單一之蛋白質帶 圖五、六 ，且野生型及突變型 都能有很高之產 ( 75 %) ( 8) ( ) K162A 率 大於 及純化倍數 大於 表一 ，唯突變型 之純化產率 (0.18 %) 及倍數 (0.3) 過低 ，若將以相同純化條件純化pET-20 載體 ，以及 將細菌粗抽取液以不經Q-Sepharose 直接以2’,5’-ADP sepharose 純化所得之 數據與之相比，我們推測突變型 K162A 在經由 Q-Sepharose 及 2’,5’-ADP sepharose 純化後之活性確為重組鴿肝蘋果酸 所表現，而在細菌粗抽取液 所觀察到2.25U 之活性應是受其他蛋白質影響，可經由Q-Sepharose 的初步 純化將這些蛋白質完全去除。所以經過Q-Sepharose 之產率應高於5 % ，但 我們仍不了解為何再經由 2’,5’-ADP sephar