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生长激素饮料 与 基因工程 2011级 一系一班 贺娟 2011221976 一、目的基因的获取 二、选择和制备合适的基因载体 三、 目的基因与载体的连接 四、重组DNA导入宿主细胞进行扩增 五、重组体的筛选与鉴定 六、克隆基因的表达 一、目的基因的获取 目的基因：生长激素基因（位于染色体17q22-24） 目的基因获取：PCR扩增生长激素基因 PCR技术扩增生长激素基因 二、选择与制备的基因载体 基因载体 ：质粒 PUC质粒载体 （1） pUC质粒载体的结构 一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因；（iv）位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。　　　　　　　　　　　　　 （2）pUC质粒载体的优点 第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC8为2 750bP，pUC18为2686bP。 pUC8质粒平均每个细胞即可达500～700个拷贝。 第二，适用于组织化学方法检测重组体 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的:acZ′基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用Xgal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。 第三，具有多克隆位点MCS区段 pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNΑ片段，可以方便地从pUC8质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核着酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。 PUC18/19 三、目的基因与载体的连接 内切酶:(1)核酸内切酶||类酶‖ (2)切割方式：错位切割和垂直切割 CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAA AATTCCGTAG EcoRI 剪切目的基因 CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAA AATTCCGTAG 目的基因 黏性末端 连接方式：黏性末端连接 四、重组DNA导入宿主细胞进行扩增 重组DNA导入导入大肠埃希菌 五、重组体的筛选和鉴定 方法：遗传学方法、免疫学方法、分子生物学方法 此处采用遗传学方法中的抗生素抗性筛选（如图） 六、克隆基因 的表达 ――原核生物表达系统 大肠埃希菌表达体系 （1）目的基因：生长素激素基因 （2）载体：强启动子――trc启动子 核糖体结合位点――SD序列（可与核糖体30S小亚基 中的16S r RNA 3’-端的部分序 列互补结合） 终止转录序列――防止外源基因表达干扰载体