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Western Blot详解 导师：苏琦 教授 学生主讲：张翔 上图为Burridge K于1976年在其论文中发表，是将SDS聚丙酰胺平板凝胶电泳的高分辨率和易操作性与电泳后抗原的定位分析相结合的第一个例子，此法是将电泳后凝胶浸入含有标记的溶液内，然后洗去未结合的抗体，直接检测凝胶中的抗原。 随着技术的进步稍后的方法是使凝胶扩散到经过处理的纸条上，通过共价结合将抗原固定。使其在适当的纸面上呈现分离的蛋白条带。后来将蛋白以非共价结合的方式结合于硝酸纤维素滤膜，它不是通过简单扩散而是以电洗脱方式转移至膜上，再将化学发光技术应用于抗原检测，极大的提高了免疫印迹的灵敏度，使其成为最为广泛的免疫化学方法之一。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 所需仪器 电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 Western前准备工作 一、抽提目的蛋白 1.蛋白来源：①蛋白质溶液②细胞裂解液③免疫沉淀蛋白。 2.蛋白定量： 检测方法 电泳（Electrophoresis） 1.SDS凝胶配制 2 .上样：冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶） 2、按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。） 3、当水和胶之间有一条折射线时（37℃30min），说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 4、按前面方法配的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 电泳时需注意的事项 1）电泳中只有在恒压的条件下电泳期间蛋白质才可以保持恒定的迁移速率。 2） 电泳出现不规则的蛋白质迁移多是因为电流不稳定。（或者是样品孔上样量太多；样品盐浓度太高；边缘效应） 3） 为了避免边缘效应可以在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 4） 煮沸变性的样品可以在-20 ℃保存数周但要避免反复冻融导致蛋白质降解。 电泳注意事项及常遇到的问题 1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。 2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是 5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。 3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多， 此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量 不够或者系统实际不纯或实效。 4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 5）电泳中常出现的一些现象： ︶ 条带呈笑脸状：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 ︵ 条带呈皱眉状：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。