对羟基苯甲酯类混合物的反相高效液相色谱.doc

对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱 一 目的要求： 1 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量； 2 熟悉高效液相色谱仪的结构； 3 熟悉高效液相色谱分析操作（流动相的设置、检测波长的设置、运行时间设置、保留时间和峰面积的获取）。 二 基本原理 在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。 由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。 本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同： 对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，故上式可简化为： 三 实验主要仪器和试剂 LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）配紫外检测器，色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150mm×4.6mm，5? 试剂：1．对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯；二次蒸馏水 标准溶液的配制：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯用甲醇作溶剂分别配制成1000?g/mL标准贮备液；用甲醇稀释成10?g/ml标准工作液；标准混合工作液分别含四种酯类化合物10?g/mL的甲醇溶液。（浓度仅供参考，记录实验中具体使用的浓度） 四 实验条件 （3、4、5仅供参考，记录实验中具体的操作条件） 1．色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5?m）， 2．检测器：紫外光度检测器，检测波长254nm 3．流动相：甲醇：水(Ｖ１：V2)，流量1mL/min（以在混合试样中能分开） 4．进样量：5?L 5．柱温：30 五、实验步骤 1．在淋洗瓶中装入足够量的甲醇和水，分别脱气5min； 2．根据实验条件，设定各操作条件的参数，然后开始走基线，待仪器液路和电路系统达到平衡 时，记录仪基线呈平直，即可进样。 3．依次分别吸取5?L的四种标准工作液及标准混合工作液和未知试液进样，记录各色谱图，并各重复1次。在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。 六 数据记录及处理 1．记录实验条件 (1) 色谱柱：日本岛津公司（Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm）， (2) 流动相： (3) 检测器： (4) 进样量： (5) 柱温： 2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间tR，并填于下表1。 表1 四种对羟基苯甲酸酯化合物的保留时间 保留时间 组分 tR（min） 1 2 平均值 对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸乙酯 对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丁酯 3．依次测量标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间tR（min）值，并填入表2，然后与上表中h值对照，确定各色谱峰代表何种化合物。 表2 未知试样色谱图 保留时间 组分 定性分析 定量分析 tR（min） 相应化合物名称 峰面积 相应化合物% 1 2 1 2 峰1 峰2 峰3 峰4 七 思 考 题 1．归一化法定量的使用条件？本实验为什么可以采用归一化法定量？ 2．在高效液相色谱中，为什么可利用保留值定性？这种定性方法你认为可靠吗? 3．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。 4. 本实验中怎样调整流动相的比例改变保留时间，举例说明