与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析论文.docVIP

　　与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析论文 杨继要,张慧珍,王静,吴逸明,买淑鹏 【摘要】 目的 从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。 方法 以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株，再经PCR进一步鉴定，确定含有单链抗体基因的克隆并测序，测序结果通过GeneBank 比对进行同源性分析。结果 获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA 测序后,在Genebank 中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论 从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。 【关键词】 肺癌；噬菌体抗体库；HSP70；筛选 Identification and Sequence Analysis of Fused scFv Antibody Binding Specifically to HSP70 Key ersham 公司。鼠抗人HSP70一抗、兔抗鼠二抗购自北京中山公司，抗原HSP70由我研究室从肺癌组织中提取总蛋白，经过ConA亲和柱、透析、DEAE离子交换柱获得，经13扩增并定量稀释到1×1012 pfu/ml,分装后置4℃保存。 1.2.2 噬菌体抗体库的扩增和抗体库滴度测定 (1) 噬菌体抗体库的扩增取100μl原库菌液，接种到100ml 2YT-AG（含100μg/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖的2YT）培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；加1ml辅助噬菌体KM13于25ml培养液，37℃水浴30min，4℃离心后弃上清；用50ml 2YT-AK（含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素的2YT）重悬沉淀，37℃培养过夜；4℃离心，上清即为扩增后的噬菌体抗体库。加10ml PEG/NaCl 于上清中，冰浴1h后离心弃上清，用PBS洗涤沉淀，再重悬于含15%甘油的PBS中，-70℃保存。 (2) 抗体库滴度测定取1μl浓缩后的抗体库上清，用PBS 100倍梯度稀释，每个稀释度均加入900μl 新鲜制备的大肠杆菌TG1（OD600＝0.4），37℃水浴30min后涂TYE平板，37℃培养过夜。次日计数菌落估计噬菌体抗体滴度：用噬菌体颗粒的菌落形成单位表示，pfu/ml＝集落数×稀释倍数。定量稀释到1×1012 pfu/ml保存。 1.2.3以肺癌组织中纯化的HSP70为抗原对抗体库进行四轮筛富集选 以纯化的HSP70（10μg/ml）包被酶标板4个孔，室温放置过夜；次日用2%MPBS（含2%脱脂奶粉的PBS）室温封闭，每孔加1μl融合抗体上清和100μl 2%MPBS，室温孵育；弃上清，洗孔后，加入含胰酶的PBS 400μl 洗脱噬菌体；加200μl洗脱液于1.8ml OD600=0.4的TG1菌液中，37℃水浴30min后，取10μl涂TYE平板，37℃培养过夜，次日从TYE板上刮下菌落，所得到的菌落被扩增并用于制备下一轮筛选用噬菌体。剩余则测噬菌体抗体滴度。共进行四轮筛选。计算每轮投入和产出率。 1.2.4抗体库的初步鉴定 (1) 从单个含噬菌粒细菌克隆制备融合抗体 从每一轮筛选后过夜培养的TYE平板上随机挑取12个单个细菌克隆，接种到含200μl 2YT-AG 的酶标板孔中，37℃振荡培养过夜，标记为母板；另取一块酶标板，标记为检测板，每孔加200μl 2YT-AG，从母板中取10μl过夜培养物于检测板相应孔中，37℃振荡培养1h；每孔加入1μl辅助噬菌体KM13，37℃振荡培养1h。离心弃上清，每孔加200μl 2YT-AK，培养过夜，离心，上清即表面表达有融合抗体的单克隆噬菌体，4℃保存。 (2) 单克隆噬菌体与HSP70结合的ELISA检测 抗原HSP70包被酶标板（操作同上），向每孔加50μl单克隆噬菌体抗体上清液，2%MPBS洗涤后，加入二抗HRP-anti-M13；阳性对照为一抗（鼠抗人HSP70），二抗（兔抗鼠lgG）；阴性对照仅加入2%MPBS。以TMB为底物,2M 硫酸终止反应,.freell。 2.2噬菌体淘洗产率 以纯化的肺癌相关蛋白HSP70为抗原进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，洗脱的噬菌体产率显示第四轮与第三轮的回收率相近,说明经过筛选后阳性克隆已得到富集,见表1。表1各轮筛选过程中噬菌体的回收率 筛选次数投入量产出量回收率（%）1 4.2×10138.0×1021.9×10-92 2.4×10132.0×1058.3×10-73 3.0×