幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达论文.docVIP

　　幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达论文 .freelper-ature induce Abstract:AIM To amplify and clone the middle region of Helicobacter pylori cagA gene，and express the proteins in E.coli.METHODS After the cag1and cag2plified by PCR and sequencd by dideoxy methods，they oters.The rebinant plasmids pBVcag1and pBVcag2ed into E.coli DH5αand induced at42℃respectively to express the encoded pro┐teins.RESULTS The middle region of cagA plified and975，755bp products ounted to36%and24%of total bacterial protein respectively.CONCLUSION The H.pylori cagA middle region might be successfully cloned and efficiently expressed fractionally in E.coli. 0 引言 毒素相关基因A（cytotoxin-associated gene，cagA）基因是cag致病岛的一部分，其OFR约3542bp左右，3’端存在变异，相应蛋白Mr 为（1.28～1.40）×105［1］ ，是胃内致病微生物幽门螺杆菌（Hp）主要的毒力因子之一，参与胃、十二指肠溃疡及胃癌等的发病，并与疾病的转归有关［2-4］ .中国Hp感染率高达80%以上，且大多为cagA+ Hp的感染［5］ .现在一些Hp标准菌株的cagA基因已克隆［6，7］ ，其表达产物cagA具有较强的抗原性，其滴度可反应Hp株间的毒力差异，而且和疾病发展也有一定的相关性［1］ .对Hp感染的检测可通过对抗cagA抗体的检测进行.将cagA分段表达，同时用来检测患者血清，可以更全面、准确、清晰地了解患者Hp的感染情况.我们利用原核表达系统分段克隆表达cagA基因中间区，为Hp感染的检测及治疗提供基础. 1 材料和方法 1.1 材料 大肠杆菌JM109，DH5α，pUC19及pBV220质粒为本所保存;pMC3为含cagA基因5’端大部分的pBluescript质粒，由美国Vanderlilt大学Tummuru博士惠赠.限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶均为宝生物公司产品. 1.2 方法 据标准菌株cagA序列［6，7］ 设计PCR引物，进行分段扩增: cag1正向ACAGAATTCATGGACATGGATCCC AATTACAAGT反向GTTGTCGACTTACTCGTCATAGTT GCCTGTGTT cag2正向AGAGGATCCATGGAGGTGAAACGA GCTCAG反向TCACTGCAGTGGCCTCTATTCCAG ATAACC cag1正向引物加起始码（ATG）及EcoRI酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及SalI酶切位点;cag2正向引物加起始码（ATG）及BamHI酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及PstI酶切位点.以pMC3为模板，反应条件为95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min.PCR产物克隆及鉴定用EcoRI+SalI（cag1），BamHI+PstI（cag2）分别双酶切纯化的PCR产物与pUC19质粒，连接外源DNA与对应线性化pUC19质粒，转化E.coli JM109，氨苄青霉素抗性及蓝白筛选，挑选白色克隆，酶切鉴定重组克隆.核苷酸序列由基康公司测序.H.pylori cag1，cag2与表达载体的重组. 目的蛋白的诱导表达:工程菌在含氨苄青霉素（100mg L-1 ）的LB培养液中30℃振荡过夜，次日按1%转接扩大培养，继续30℃振荡2～4h，当A600nm =0.6时，立即转入42℃水浴摇床快速振荡5h. SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS）:4℃离心收集菌体，用含3mL L-1 巯基乙醇载样液处理（100℃6～8min），考马斯亮蓝R-250染色. 2 结果 PCR扩增cag1，cag2，分别得到975和755bp的片段（Fig1）.随机挑选白色克隆，经双酶切鉴定，证实含有975和755bp的插入片段（Fig2）.阳性克隆送交基康公司测序，测序正确.