细胞培养58153.pptVIP

细 胞 培 养 池文杰 一、细胞培养的基本知识 (一)培养细胞的特性 1.培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。 2. 培养细胞的生长特点： a.贴附 贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长。 b.接触抑制及密度依赖性 3. 细胞培养的生长过程 (1) 细胞系的生长过程(三个阶段)： a.原代培养或初代培养期 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养(1～4周) b.传代期 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种至两个或者更多的培养器皿中(数天到一周左右) c.衰退期 在此期间细胞开始时虽仍然存活，但生殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡(传代30～50次以后) (2) 每代细胞的生长过程 a.滞留期：包括游离期及潜伏期 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮态，也称为悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min～4h 潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24h。 b.指数生长期： 又称对数期。此期间细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞生长增殖状况可以依据细胞倍增情况(细胞群体倍增时间)及细胞分裂指数等来判断。(3～5天) c.生长停止期(平台期)： 此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。 (二) 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 a.基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子 b.促生长因子等物质 c.此外激素也可有助于细胞生长 2 细胞的生存环境 a.温度: 适宜的温度与取材的动物种类有关 b.气相及pH:一般气体环境为95%空气加CO2的混合气体。 pH: 7.2-7.4 。CO2为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的pH有关， CO2增加将使pH下降。 CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- 3 渗透压：因细胞的类型及种族而异。由于人类血浆的渗透压约为290m mol/L，因此认为这是体外培养人类细胞的理想渗透压。 4 无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须条件。凡与细胞直接接触者(如培养瓶、底物、培养剂等)或间接接触者(如瓶盖瓶塞等)，若具细胞毒性，都会导致细胞的死亡。污染问题包括细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及上述有害物质的污染。 二、细胞培养室的设备和准备工作 1 设备： 超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜 干燥箱，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪，压力蒸汽消毒器，滤器 离心机及天平 冰箱，细胞冷冻存储器(液氮容器或低温冰箱) 常用培养器皿：培养瓶，培养皿，多孔培养板，吸管，加样器 其它用品：离心管，冻存管，酸缸，烧杯，注射器，量筒等 玻璃：浸泡→刷洗(洗洁精)→烘干→酸泡(24h )→流 水、单蒸双蒸分别冲洗→烘干 塑料： a.滤器和注射器：清水、单双蒸各超15min→烘干 b.多孔培养板： c.胶塞，瓶盖等：流水、单蒸双蒸分别冲洗→烘干 →用双蒸水煮沸30min →烘干 消毒灭菌：高温湿热灭菌 玻璃：121 ℃，30min 塑料：115 ℃，15min(多孔板用紫外照射) 洗液的配制 1 培养用液 a.水：蒸馏水或去离子水 b.平衡盐溶液(BSS)：维持渗透压、调节pH值以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。主要作为合成培养基的基础液及用于洗涤组织、细胞等。一般用PBS缓冲液 c.消化液：0.25%胰蛋白酶液，其功能主要使细胞间的蛋白质水解，细胞分散。 2 培养基 定义：维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 合成培养基:根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前有RPMI-1640、 DMEM、 TC199、MEM等。 主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外