11细工第15章医.pptVIP

本章学习重点 干细胞的主要特性 ES/EG细胞培养建系技术 第一节干细胞概论 一、定义及特征 干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞。 干细胞的几个主要特性 （1）干细胞是未分化，尚不成熟的细胞； （2）干细胞能无限增殖分裂； （3）干细胞的增殖具有缓慢性和自稳性； （4）干细胞通过一次有丝分裂产生两个子细胞，一个保持未分化状态，另一个分化为特定细胞。 二、干细胞的分类 三、干细胞的研究概况 （一）畸胎瘤干细胞（EC） 1967年，Stevens将小鼠早期胚胎进行异位移植，发现能产生畸胎瘤。接着，一些实验室从小鼠畸胎瘤组织分离和培养建立了不同类型的恶性畸胎瘤干细胞系，即EC细胞系。 EC细胞具有恶性生长并类似胚胎细胞发育多能性的双重性质。在20世纪70-80年代，EC细胞系常被用作研究哺乳动物发育、遗传、细胞诱导分化的实验模型。 三、干细胞的研究概况 （二）胚胎干细胞（ES） 从囊胚内细胞团(ICM)经体外分化抑制培养分离的一种多能性细胞系，可分化成任何组织类型的细胞。 小鼠胚胎干细胞 1981年，Evans和Kaufrnan分别由小鼠早期胚胎建立了ES细胞系。 至今已分离得到胚胎干细胞的物种有： 金黄地鼠（1988） 恒河猴（1995） 貂（1993） 绒猴（1996） 猪（1994，1997） 人（1998） 鸡（1996） 三、干细胞的研究概况 （三）胚胎生殖细胞（EG） 1992年，Matsui以小鼠胚胎生殖嵴的原始细胞（PGC）为材料，首次成功分离得到EG细胞系。 1998年，Shamblott成功分离得到人的EG细胞系。 三、干细胞的研究概况 （四）成体干细胞（ASC） 指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，它能够自我更新并且特化形成该类型组织的细胞。 其基本功能是参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。 目前发现的成体干细胞 1.造血干细胞（HSC） 存在于造血组织内的一类能分化发育成各种血细胞的原始细胞。 造血干细胞是不均一的细胞群体，由不同年龄等级的干细胞组成。 来源：骨髓、外周血和脐带血 造血干细胞的分化 造血干细胞能生成所有血细胞：红细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞以及血小板 2.神经干细胞（NSC） 神经干细胞是指来源于神经组织并能分化为神经组织，具有自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞。 在适当条件下可分化成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞等，在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。 体外培养的神经干细胞 3.间充质干细胞(MSC) 骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体。 ※ MSC在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。 间充质细胞的分化 4.表皮干细胞 位于表皮基底层及毛囊的膨胀部位，具有强大的增殖分化潜能，在体外可分化成表皮全层细胞。 第二节 ES/EG细胞培养建系技术 ES/EG细胞培养建系技术流程 （一）ES细胞的来源 1.早期胚胎 2.妊娠早期胎儿组织 3.体细胞核移植胚胎 囊胚包括滋养外胚层、囊胚腔、内细胞团（ICM）。滋养外胚层将形成胎盘、胎膜和脐带，而内细胞团将形成胎儿。 （二）ES细胞的分离 （三）ES细胞的原代培养和传代培养 1.饲养层细胞培养法 （1）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：能产生抑制ES细胞分化的白血病抑制因子（LIF）和促进ES细胞增殖的细胞因子 （2）STO细胞：来自SIM小鼠胚胎（S），对硫代鸟嘌呤（A）和鸟苯苷（O）具有抗性的成纤维细胞系 （3） SNL细胞：转染了neo抗性基因和LIF基因的STO细胞 ES细胞饲养层细胞培养法 （三）ES细胞的原代培养和传代培养 2.无饲养层培养 （1）基础培养液+500-1000IU/ml重组LIF （2）大鼠肝细胞条件培养基 （3）大鼠心肌细胞条件培养基 （四）ES细胞系的特性和鉴定 ES细胞系的特性： （四）ES细胞的特性和鉴定 -- 细胞的形态结构 -- 核型分析 -- 特异性标志分子的表达 -- 分化能力检测 -- 嵌合体的形成 第三节 ES/EG细胞体外诱导分化 一、ES细胞体外分化的模式 1.自发分化 2.诱导分化 3.基因调控分化 利用ES细胞的体外遗传可操作性，通过强化或抑制某些基因的