斑马鱼精子冻存与体外受精.PDFVIP

斑马鱼精子冻存和体外受精 技术要点 潘鲁湲 2017年3月31 日 准备工作要点 • 鱼的准备 • 材料的准备 • 试剂的准备 • 储藏设备的准备 鱼的准备 雄鱼 雌鱼 • 年龄：6- 18个月 • 年龄：6- 18个月 • 有交配经历 • 有交配经历 • 与雌鱼隔离一月以上 • 近一周内没有配鱼产卵 • 活饵料喂养 • 健康无病，不瘦弱 • 稳定光周期 材料的准备 • 干冰：新鲜、细粉末、压实 • Falcon离心管：标记编号 • 冻存管标记：低温标签或手写 • 冻存操作记录表：P15 • 计时器 • 毛细管：刻度标记 试剂和设备的准备 o • 10x Ginsberg Fish Ringer: 4 C保藏，6个月 • 冻存液：实验当天新鲜配置 • 奶粉：全脱脂，有机奶粉，不要用western试剂 o • Hanks储液1/2/4/5：过滤除菌，4 C保藏，6个月 o • Hanks premix ：过滤除菌，4 C保藏，3个月 • Hanks buffer ：当天新鲜配置 • NaHCO ：试剂日常保存得到，不结块，不过期 3 • 液氮储藏罐：体积50L,液位有保证 精液收集操作要点 • 雄鱼麻醉 • 吸干水分 • Mounting 精液收集操作要点 • 分开腹鳍 • 用镊子挤压鱼腹 • 收集精液 精液冻存过程要点 • 以无甲醇冻存液补齐3.3ul • 混入16.7ul含有甲醇冻存液中（达到20ul） • 分装入2个冻存管 • 装入Falcon离心管中，埋入干冰 • 以上步骤尽量在1分钟内完成 • 记录样品、管号、放入时间，并计算取出时间 • 20分钟后取出样品，迅速投入液氮中 • 短期保藏（5天）：溶于50ul Hanks Buffer o • 4 C保藏 冻存精子样品复苏操作准备 • 前一天准备雌鱼：1M vs 2-3F • 用隔板隔开，不要接触 • 按照1个复苏样