第二章 蛋白质分离技术幻灯片.pdfVIP

蛋白质分离技术 一、电泳简介 二、一维等电聚焦电泳 三、二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、胶上蛋白质的检测（显色） 五、存在的问题 目前常用的分离技术 1）凝胶电泳技术 1D Gel Electrophoresis 2D Gel Electrophoresis Capillary Electrophoresis 2）色谱技术 HPLC MudPIT 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE) ：利用蛋白质的等电 点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋 白质的方法。  基本原理：第一向在高压电场下对蛋白质进行 等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第 二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)。 4 发展历史 发展概况： 合成载体两性电解质（synthetic carrier ampholyte, SCA）来生成PH梯度 非平衡PH梯度电泳（non-equilibrium PH gradient electrophoresis, NEPHGE） 固相PH梯度及与载体两性电解质两者混用 合成载体两性电解质  1975年，O’Farrell首次发表了分离大肠杆菌的 双向电泳优化方法，并成功地分离约1000个 E.coli蛋白。 利用了合成载体两性电解质（SCA）来生成PH梯 度 是混合的复合物，合成过程复杂，重复性小。 SCA的pH梯度不稳定且分子小易漂移，难以固定 在IEF胶内，由于水引起的电渗流导致阴极漂移现 象，大于7的蛋白丢失很多 非平衡pH梯度电泳 用来分离碱性蛋白。 碱性蛋白迁移速度比酸性蛋白快，将蛋白加在 酸性部分，缩短电泳时间短 重现性仍然很差 固相pH梯度及与载体两性电解质两者混用 1975年，Gasparic等合成了固相PH介质， 1982年，固相pH梯度等电聚焦技术基本完善 具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺的共价聚合， 可以形成固定的，不随环境变化的PH梯度 PH范围可以在2.5- 11，所以几乎在一张双向 电泳图谱上可以得到整个细胞产物的分离点 分辨率比传统的等电聚焦要更高，可达 0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法 聚丙烯酰胺凝胶 由于聚丙烯酰胺凝胶的凝胶孔径与蛋白质大小接近， 能达到最好的分离能力，且制胶方便，成本低，重 复性好，凝胶透明，易于显色并观察，为首选的蛋 白质分离介质。 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）是 通过丙烯酰胺（acrylamide）单体和双功能团交联 剂如N,N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-methylene bisacrylamide）按一定的比例混合，在引发剂和 增速剂存在下聚合而成的交叉网状结构。 9 2012-03-19 二、第一向等电聚焦（IEF）  等电聚焦（IEF）技术是根据蛋白质的等电点（pI）不同 将它们分开的一种电泳技术。蛋白质是两性分子；它们 整个分子要么带有正电或负电，要么不带电，这依赖于 环境的pH值。等电点(isoelectric point, pI )是一个特定 的pH 值，此时整个蛋白质分子的净电荷为零。  pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在pH梯度 凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所净电 荷为零的点移动。这就是等电聚焦效应。 11 2012-03-19 分离的程度取决于pH梯度斜率和电场强度。因此， 等电聚焦是在相当高的电压下进行的（一般超过 1000V）。当蛋白质在pH梯度上都达到最终点时， 在整个体系中很少有离子的移动，从