感受态细胞的制备及重组质粒的转化.pptVIP

感受态细胞的制备及重组质粒的转化 重组DNA技术的基本工具 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞，即感受态细胞(competent cell) 。 转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。 影响转化效率的因素 实验原理 本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。 如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。 能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。 实验仪器、材料 1 ．超净工作台 2 ．高速离心机 3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．恒温水浴锅 6 ．制冰机 7 ．移液枪 实验材料、试剂 1．大肠杆菌JM109菌株 2．重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 4．试管、培养皿 实 验 安 排 一、受体菌的培养 二、感受态细胞的制备 1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中，置冰浴5min，10000rpm离心 1min （每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳） ； 2、弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入0.5mL冰预冷 的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，置冰浴10min； 3、4000rpm离心10min，弃上清； 4、每管加入50μL冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，冰上放置， 即为感受态细胞。 三、质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化 对照组： 注意事项 感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速（所有操作均应在冰上进行）。 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作一定要轻柔。 菌液涂布操作时应避免反复来回涂布，过多的机械挤压涂布容易使感受态细菌细胞破裂，影响转化率。 操作过程中注意防止杂菌和杂DNA的污染。 思考题 experiments of molecular biology experiments of molecular biology 重组DNA技术 分：分离外源基因目的基因。 切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。 转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。 筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。 “分子手术刀” 限制性核 酸内切酶 “分子 运输车” “分子 缝合针” DNA 连接酶 “分子 运输车” 基因进入 受体细胞 的载体 感受态细胞(competent cell) 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。 转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化（transformation） 化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 转化的方法 转化原理（CaCl2法） 将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域； 此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； 经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。 CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15-30％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。 影响 因素 细胞生长状态和密度 杂菌和其它外源 DNA 的污染 载体DNA及重组DNA 受体细胞 试剂的纯度和 器皿的洁净度 转化操作 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 1． LB液体培养基 2．含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50μg／mL） 3．氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液 1 受体菌的培养 感受态细胞的制备 2 3 质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化 实验 安排 从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右