抗菌药物敏感性试验与细节耐药检测.doc

抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测 来源：检验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6 一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验 (一)纸片琼脂扩散法 纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer试验，是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。 1．试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。 2．培养基和抗菌药物纸片 (1)培养基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培养基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH值为7.2～7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为4mm。配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。 (2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。含药纸片密封储存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，且不超过l周。使用前将储存容器移至室温平衡l～2h，避免开启储存容器时产生冷凝水。 3．细菌接种 细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度。校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育24h。 4．结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径(抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域)，当葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的敏感试验，围绕纸片周围只要有极少细菌生长提示为耐药。对另外一些菌，在抑菌圈内散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。变形杆菌迁徙生长使抑菌圈内生成的薄层菌可忽略不计。由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶引起的轻微细菌生长，生长层小于20％可忽略不计。根据CLSI/NCCLS标准，对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐药)。 (二)稀释法 如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量(浓度)的抗菌药物呈敏感时，就必须使用稀释法(dilution method)。稀释法包括两 种：肉汤稀释法和琼脂稀释法，分别介绍如下： 1．肉汤稀释法 有常量稀释法(mac-rodilution)和微量稀释法(microdilution)，前者含药肉汤含量每管≥l.0ml(通常2m1)，后者每孔含0.1ml。商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素，操作方便，广泛应用于临床。 (1)培养基：使用M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充基质可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正pH值为7.2～7.4(25℃)。离子校正的M-H肉汤(CAMHB)为目前推荐的药敏试验培养液。 (2)药物稀释①药物原液制备：抗菌药物直接购自于厂商或相关机构，所需的溶液量或粉剂量可根据下述两公式进行计算。 质量(mg)=溶剂（ml）×浓度（ug/ml）/分析效能（ug/mg） 容积(m1)= 质量(mg) ×分析效能（ug/mg）/浓度（ug/ml） 配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pH值为6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。 一般原液浓度不低于1 000ug/ml或10倍于最高测试浓度，原液应储存于-60℃以下，保存期不超过6个月。②稀释抗菌药物的制备：行2倍系列稀释，使其终浓度(ug/m1)为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125等。 (3)菌种接种：配制0．5麦氏浓度菌液，用肉汤(常量稀释法)、蒸馏水或生理盐水(微量稀释法)稀释菌液，使最终菌液浓度(每管或每孔)为5×105 CFU／ml，稀释菌液于15min内接种完毕，35℃孵育16～20h，当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为20～24h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时