慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达论文.docVIP

　　慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达论文 【摘要】 本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统，并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道（PPT）元件、泛醌启动子（PUB）和绿色荧光蛋白基因（GFP）连接至pLO134载体，构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSVG）共转染293T细胞，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞，在荧光显微镜下和应用流式细胞仪（FACS）观察感染情况。结果表明：慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，FACS分析转染效率为（63.04±7.24）%，病毒滴度测定为（3.09±0.61）×106 U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后.freelphocytes Mediated by Lentiviral Vector Abstract This study id system of the lentiviral vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene and to investigate the expression of GFP in T lymphocytes of the mouse. The polypurine tract (PPT) element, ubiquinone promoter (PUB) and GFP id pLO134 using subcloning technology to construct plasmid pTK153. Human kideny 293T cells id system containing packaging plasmid △NRF, plasmid pTK153 and envelope plasmid VSVG by using calcium phosphate DNA precipation and the expression of GFP icroscope after 12 hours. The viral particles ouse T lymphocytes at multiplicity of infection (m.o.i .) of 3. The expression of GFP in mouse T lymphocytes icroscopy and fluorescenceactivated cell sorting (FACS). The results shol. The expression of GFP ouse T lymphocytes and the transduction efficacy id system of lentiviral vector containing GFP gene is successfully constructed and the transduction efficacy is high in mouse T lymphocytes. Key ouse T lymphocytes; green fluorescent protein gene J Exp Hematol 2007; 15(1):125-128 逆转录病毒载体（retroviral vector， RV）系统已被广泛应用于临床前及临床的基因转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因治疗受到了一定的限制［1］。围绕这一问题，近年来人们把目光投向了来源于包括人类免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus1， HIV1）在内的慢病毒载体（lentiviral vector， LV）。LV最大的特点是可以感染非分裂期细胞如神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞等［2］。我们构建了以HIV1为基础的LV三质粒系统，并以绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein gene， GFP）作为标志基因，观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。 LV三质粒系统的构建及鉴定 用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别从pTK131、pTK145及pTK54切下PPT元件、PUB启动子及GFP基因，用T4DNA连接酶依次将PPT元件、PUB启动子及GFP基因连接至由BamHⅠ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去除5P的载体pLO134上，