新建 酶切医.docVIP

甲酰胺 EDTA（乙二胺四乙酸） 10%过硫酸铵 尿素 TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺） 丙烯酰胺 N,N’-甲叉双丙烯酰胺 溴酚兰 【仪器设备】 冰，4、37、70水浴 PCR反应仪 高压电泳仪 测序电泳槽 微量移液器 X光片 3?操作程序 1．基因组DNA的酶切 在下列反应中加入： 0.1~0.5mg?DNA 5单位EcoR?I（Pharmacia） 5单位Mse?I（N.?E.?Biolabs） 8ml?5×RL＋-buffer 加无菌水至40ml，37保温1小时或1小时以上。 2．人工接头的连接 （1）人工接头的准备： Mse?I-接头： 5-GACGATGAGTCCTGAG ?????????????????????TACTCAGGACTCAT-5 取16mg（≈3000?pmol）上链（16?mer）和14mg（≈3000?pmol）下链（14?mer），并加无菌蒸馏水至60ml，这样便获得了浓度为50?pmol/ml的Mse?I接头。 EcoR?I接头： 5-biotine-CTCGTAGACTGCGTACC ?????????????????????CATCTGACGCATGGTTAA-5 取1.7mg（≈300?pmol）上链（17mer）和1.8mg（≈300?pmol）下链（18mer），并加无菌蒸馏水至60ml，这样便获得了浓度为5pmol/ml的生物素标记的EcoR?I接头。（2）人工接头的连接 在上述基因组DNA酶切反应中加入下列10ml的混合物： 1.0?ml?EcoR?I接头（=5?pmol） 1.0?ml?Mse?I接头（=50?pmol） 1.0?ml?10?mM?ATP 2.0?ml?5×RL-buffer 1单位T4?DNA连接酶（Pharmacia,?5单位/ml） 加无菌蒸馏水至10ml 37保温3小时或3小时以上。 3．生物素标记的DNA片段的选择 用100ml?2×STEX溶液倾斜10ml小珠（beads），然后将小珠加到上述DNA溶液中使得其终浓度为100ml。在室温中轻摇30min，使得生物素标记的DNA酶小珠充分结合。用磁铁收集小珠，先用100ml?1×STEX清洗，然后用100ml?STEX溶液悬浮在一个新的小塑料管中。接着再用100ml?STEX清洗2次，最后使之悬浮在200ml?TE0.1溶液中，4保存备用。4．AFLP反应（一步法） （1）引物的标记 10ml?g32P-ATP（10mCi/ml?of≈3000?Ci/mmol，AP?66pmol） 5.0ul?10×T4-buffer 1.0ml?T4-Kinase（Pharmacia?10?Units/ml） 14.0ml?H2O 共40.0ml含32P的反应混合物 之后加入10ml?AFLP引物（50ng/ml），37保温30min或30min以上。最后7010min使T4-Kinase失活。32P标记的引物的终浓度为10ng/ml。 （2）AFLP反应混合物的制备 引物/dNTPs混合物的制备： 5.0ml?32P标记的AFLP引物1（10ng/ml） 6.0ml未标记的AFLP引物2（50ng/ml） 8.0ml?5mM?dNTPs 31.0ml?H2O 共50.0ml，可供10次反应使用。 Taq聚合酶/缓冲液混合物： 20.0ml?10×PCR?buffer 0.8ml?Taq聚合酶（5单位/ml，Perkin?Elmer） 79.2ml?H2O 共100ml，可供10次反应使用。 AFLP反应混合物的制备： 5.0ml模板DNA（从200ml悬浮的小珠中吸取） 5.0ml引物/dNTP混合物 10.0ml?Taq聚合酶/缓冲液混合物 （3）扩增反应 按下列条件进行PCR扩增 变性94?30s 复性65?30s 延伸72?60s 1个循环后，在循环2～13时，使复性的温度降低0.7，在循环14～36时，按下列条件进行PCR扩增： 变性94?30s 复性50?30s 延伸72?60s （4）二步AFLP 当引物选择碱基数为3个或3个以上，扩增反应分为二个步骤：预扩增和扩增。 预扩增： 引物/dNTP混合物的制备： 5.0ml未标记的AFLP引物1（50ng/ml） 6.0ml未标记的AFLP引物2（50ng/ml） 8.0ml?5?mM?dNTPs 31.0ml?H2O 共50.0ml，可供10次反应使用。 Taq聚合酶/缓冲液混合物： 20.0ml?10×PCR?buffer 0.8ml?Taq聚合酶（5单位/ml，