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镉致腺垂体 【摘要】 目的 观察CdCl2作用后腺垂体肾上腺皮质系统凋亡情况及半胱天冬酶9的表达变化。方法 48只雄性SD大鼠随机分为4组，即对照组、CdCl2低剂量组(10mg／kg)、中剂量组(20mg／kg)、高剂量组(40mg／kg)。经口灌胃染毒，每周5d，连续6周。染毒结束后分离腺垂体和肾上腺皮质进行透射电镜观察、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡、半胱天冬酶原9mRNA(procaspase9mRNA)表达、半胱天冬酶9(caspase9)表达。结果 电镜检查可见凋亡细胞早期形态学变化；中、高剂量组腺垂体和肾上腺TUNEL阳性细胞的平均灰度值和procaspase9 mRNA阳性细胞相对灰度值均为对照组的12倍以上(Plt;005)；蛋白印迹（western boltting)结果显示，随着染毒剂量的增加，垂体-肾上腺系统caspase9表达逐渐增强(Plt;001)。结论 CdCl2可诱发腺垂体-肾上腺皮质细胞凋亡，在此过程中caspase9及其酶原mRNA表达呈现出与凋亡较为一致的趋势。【关键词】 镉　　应激是机体面临或觉察到环境变化(应激原)对机体有威胁或挑战时作出的适应和应对过程，腺垂体肾上腺皮质系统兴奋是应激过程中主要的内分泌改变〔1〕。镉作为一种常见的应激原，其作用于机体后腺垂体肾上腺皮质系统的反应报道较少。我们从镉作用后腺垂体肾上腺皮质系统的形态学变化及细胞凋亡发生的角度，观察镉亚慢性染毒后腺垂体肾上腺皮质系统细胞凋亡情况及在此过程中，半胱天冬酶9(cysteinvl aspartate specific proteinase9，caspase9)及其酶原(procaspase9)mRNA的表达水平，为深入研究镉的内分泌毒性提供基础资料。　　1 材料与方法　　11 实验动物 清洁级雄性SD大鼠(中山大学动物中心；合格证号：粤检证字2001A039)，体重190～210g，实验前检疫1周。　　12 试剂与仪器 氯化镉(CdCl2·5H2O，纯度gt;99％，广州化学试剂厂)；焦碳酸二乙酯(DEPC,美国Amresco公司)；procaspase9mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德公司)；ZeissAxiovert研究型显微镜(德国ZEISS公司)；JVC ky2F30B 32CCD彩色图像摄录输入仪(日本JVC公司);Kontron IBAS215型全自动图像分析系统(德国Kontron公司）;SpectraA240??原子吸收分光光度计(美国Spectra公司)。　　13 实验方法 将48只动物随机分为4组，每组12只，分别于每天上午8～9时经口灌胃给予10，20，40mg／kgCdCl2溶液，阴性对照组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，每周5d，连续6周。于染毒结束的次日晨8～9时断头处死大鼠，留取血清、腺垂体、肾上腺皮质进行测定：(1)应用石墨炉-原子吸收分光光度法测定血清镉水平；(2)取部分腺垂体和肾上腺皮质置于戊二醛—中性甲醛液中固定、制片、染色，HITACHI 600型透射电镜观察腺垂体和肾上腺皮质细胞超微结构变化；(3)采用原位末端标记法检测(TUNEL)细胞凋亡，并分析TUNEL阳性细胞的平均灰度；(4)采用原位杂交法并分析Procaspase9mRNA表达水平；(5)用聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白印迹化学发光法检测caspase9表达水平并用全自动图像分析系统进行吸光度分析。　　14 统计分析 采用SPSS 100软件进行方差分析、回归分析、相关分析等。　　2 结果　　21 血镉水平变化(表1) CdCl2染毒6周后，3个剂量组大鼠血镉水平明显升高，(Plt;005)，且随染毒剂量的增加，血镉水平呈不断升高趋势，回归方程为Y∧=0718+0111x(Plt;005,R2=0885)。　　22 腺垂体和肾上腺皮质细胞形态学改变 电镜可见，中、高剂量组腺垂体细胞及3个剂量组肾上腺皮质细胞均出现了线粒体肿胀成空泡状，嵴模糊甚至消失；细胞核体积缩小，核膜不规整，染色质边聚等细胞凋亡征象。　　23 TUNEL法原位检测凋亡(表1) 结果表明，中、高剂量组腺垂体组织和肾上腺皮质组织中TUNEL阳性细胞平均灰度值与对照组比较呈现增高，凋亡细胞的平均灰度随CdCl2剂量增加趋于增强，呈明显的剂量依赖关系，以剂量为自变量，腺垂体组织TUNEL阳性细胞平均灰度值为因变量的回归方程为Y∧1=24648+4002x(Plt;005，R2=0684)，肾上腺皮质组织TUNEL阳性细胞平均灰度值为因变量的