MicroTime200时间分辨荧光显微镜.PDFVIP

MicroTime200 时间分辨荧光显微镜 在荧光寿命成像(FLIM)中的应用 荧光发射包括光谱(频域)特征和时间(时域)行为两方面的信息。近一、二十年来随着激 光、弱信号快速检测和计算机的进展，瞬时光谱的时间分辨率从毫微秒(10-9s)向皮秒(10-12s) 甚至更短的时间(10-14~10-15s)进展，检测灵敏度和数据分析处理的能力也在不断提高。超短 脉冲激光器的发展为共焦显微术增加第四个维度提供了一个极好的机会，即把时间维度引入 到该技术中来。该技术使人们能够测量与时间相关的3D 像，因此取得样品的动态信息以及 对隐藏在高散射介质中的物体成像成为可能。这种超短脉冲照明下的共焦显微术是目前最活 跃的研究领域。从 20 世纪 80 年代末才开始的荧光寿命成像(FLIM)显微术正是这样一种技 术，它既具有高的空间分辨率，又具有高的时间分辨率。 激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy ，简称LSCM ）是近代 生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置， 使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微 细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、pH 值、膜电位等生理信号及细胞 形态的变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经 生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领 域新一代强有力的研究工具。 现介绍德国Picoquant公司的时间分辨共焦荧光显微镜MicroTime 200在荧光寿命成像 . (FLIM)中的应用。MicroTime 200 包括一套完整的光电装置，用于记录显微样品的荧光衰减。 o C 其数据格式允许荧光相关光谱与时间相关单光子记数结合使用。使用 MicroTime 200 可以 s ie 获得亚微米级空间分辨率与皮秒级时间分辨率。使用最新的Olympus IX 71 倒置型显微镜， g lo 用途广泛，比如用于2D 或3D 荧光寿命成像（FLIM ）共聚焦探测。 hno c Te 实验装置 C S T E 激光扫描共聚焦显微镜 MicroTime 200 系统实验装置如上图所示，皮秒半导体激光器 发出的波长为 468nm 的激光束通过窄带滤波片后，经过中心波长485nm 的分色反射镜使 光束偏转90 度，经过高数值孔径物镜（100X，NA 1.3 ）会聚在物镜的焦点上，样品中的荧 光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，取样时间设置为 90 秒，波长大于 500nm 的荧光通过长通滤光片，由雪崩光电检测器接收，由TimeHarp 200 TCSPC 卡进行时间相 关单光子计数来获得数据采集。 完整的系统包括：显微镜，3D 压电扫描台，时间分辨共焦探测器，半导体激光器，扫 描控制器，电脑以及LSM 控制软件、数据采集卡。 测试结果与成像分析 o.