内标的选择.ppt

内 标 的 选 择 为什么要用内标法 内标法 指选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号之比为定量依据，测定待测组分含量的方法。 1. 体内药物分析的特点 （1）药物浓度低 （2）内源性杂质干扰 样品预处理是必经步骤 在预处理过程中,提取时通常不采用反复提取的方法，多半只进行一次（至多两次）提取，一般并不考虑“提取尽药物”。 要达到样品定量测定的目的，提取溶剂必须精确加入，提取液要定量转移，在以后的各个阶段，如蒸发、溶解以及衍生化、进样操作中也要尽可能一致，才能确保各份样品提取率一致 在实际操作中，往往难于达到每次操作的完全平行，因而会引入较大的误差。这种情况下，采用内标法定量就很有必要 内标的基本要求 1. 供选作内标的化合物或药物,其理化性质必须和被测组分十分相近 例如，内标在水相和有机相中的分配情况、挥发性、对萃取容器的吸附性以及层析行为等应与被测组分相似 。分配行为与挥发性近似，才能保证与被测组分有平行的回收率；层析行为相近，其保留时间、峰形才能与被测组分近似，二者峰面积（或峰高）比值才恒定 2. 内标的色谱峰应靠近被测组分的色谱峰，最好位于几个被测组分色谱峰的中间，但又能完全分离 3. 内标浓度的选择 一般内标加入量应控制在使标准曲线中段的药物与内标物响应值（注意不是浓度）比近似为1 4. 对内标的纯度要求 从实际应用角度出发，不苛求内标具有高纯度与高含量，只要求在同一次测定中，标准曲线和样品各管内内标加入量相等 5. 内标物能很好地溶解在样品中，但不能与样品发生化学反应 6. 供作内标的化合物不应当是体内的内源性成分，或药物在体内可能产生的代谢物，并且最好不用患者可能同时使用的其他药物 HPLC为分析方法时内标的选择 一般选择化学结构与被测药物相似的另一种药物或化合物作内标，具体可从以下几个角度考虑 内标与被测药物只相差一个化学元素 例如，测定血浆中的5－氟尿嘧啶（5－FU）时，可用5－氯尿嘧啶（5－CU）作内标 内标与被测药物为同系物 例如,测定血中乙醇含量时，可用丙醇作内标 内标物与被测物结构相似（应用最多的方法） 例如，体液中抗癫痫药物苯巴比妥的测定，常选用化学结构相似的扑米酮作为内标 少数情况下，也可以选择结构不相似的化合物或药物作为内标，但其理化性质也必须与被测药物相近 例如，曾经泽等在用RP－HPLC测定口服苯妥英钠后尿中对羟基苯妥英（P-HDPH）含量时，选择了一般化学试剂对硝基酚作内标 GC为分析方法时内标的选择 应用GC进行体内药物分析时，内标的选择基本与HPLC中相同，但由于GC法本身的一些特点，相应带来一些必须考虑的因素 内标物必须有一定的挥发性，在所选择的GC条件下能够气化 GC测定一般需要在120度以上柱温条件下进行，因此内标必须是遇热稳定的 GC中，衍生化经常是必需的，内标物必须和待测组分发生相同的衍生化反应 GC测定时若采用氮－磷检测器（Nitrogen Phosphorus Detector，NPD）或电子捕获检测器（Electron Capture Detector，ECD）时内标仅仅与待测物结构相似还不够，必须相应地含有N（P）或卤素原子，才能被检测器所检测到 例如，用GC测定血清中的氯丙嗪时，采用的是ECD检测器，此时若采用丙嗪作内标，虽然结构很相似，但由于丙嗪分子结构中无电子亲和性很强的氯元素，因此对ECD不敏感，不能产生色谱峰 MS作为检测器时内标的选择 内标在GC－MS、LC－MS中的作用完全与应用于GC、HPLC中的内标 相同，内标选择的方法既有相似之处，也有本身的一些特点 1. 选择与被测药物结构相近的另一种药物或化合物作为内标 选择的方式以及对内标的要求与色谱法完全相同。例如，用GC－MS测定血浆中的利多卡因及其代谢物去乙基利多卡因浓度时，可选择三甲卡因作为内标 2. 选择与被测物具有相同质荷比离子的化合物作为内标 由于在质谱检测时，内标与药物都具有相同质荷比的特征离子，因此检测时就可进行单离子监测，不仅可提高灵敏度，而且可简化操作 内标和待测物虽具有相同的m/z，但因为先经GC柱分离，到达MS就有先后，故可被MS分别检测，不会相互干扰 由于只进行单离子监测，特