生化检测方法汇总指南.docVIP

一、血清谷丙转氨酶（SGPT）赖氏改良法 器材:试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清 试剂: （1）0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液： ①0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4℃保存。 ②0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml, 4℃保存。 ③将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。 （2）标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL） ： 取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。 （3）SGPT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) : 取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH 7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。 （4）GOT底物液(DL–天冬氨酸200mmol/L ,α-酮戊二酸 2mmol/L):称取α- 酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。 （5）2.4-二硝基苯肼溶液: 取分析纯2,4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。 （6）0.4mol/L NaOH溶液: 称取16g固体NaOH，用蒸馏水溶解，冷却至室温，定容至1000mL，备用。 操作步骤： 标准曲线绘制：取试管18支按下表操作。 试 管 号 对 照 1 2 3 4 5 丙酮酸标准液（1毫升2微克分子） 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 SGPT或SGOT底物 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1M磷酸盐缓冲液PH7.4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 相当于谷丙转氨酶单位 0 28 57 97 150 200 相当于谷草转氨酶单位 0 24 61 114 190 — 每个样做3个平行，置37水浴30分钟，各管加2，4-二硝基苯肼液0.5mL，混匀，再在37℃水浴中放置20mL，各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL，混匀，10分钟后，从水浴箱中取出，以蒸馏水调“零”点，用520nm波长比色，读取各管之吸光值，各管之吸光值均减去空白的吸光值，然后以吸光值为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。 2、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。 试剂 样品测定（每个样3个平行） 对 照（每个样3个平行） 血 清（mL） 0.1 0.1 SGPT或SGOT底物（mL） 0.5 — 置37℃水浴30分钟（SGOT为37℃，60分钟后再加枸橼酸苯胺1滴） 2.4-二硝基苯肼（mL） 0.5 0.5 置37℃水浴20分钟 SGPT或SGOT底物（mL） — 0.5 NaOH溶液（mL） 5.0 5.0 对照及样品各做3个平行，充分摇匀，静置10分钟后，用520nm波长比色，以蒸馏水调节零点，读取吸光值，用样品减去对照吸光值，求得样品的谷丙转氨酶活力。 谷丙转氨酶活性单位： 37℃， pH7.4，每小时每毫升血清催化生成1μmol 丙酮酸为1个单位。例：0.1ml血清每小时催化生成0.1μmol丙酮酸, 即相当于GPT 100U / 100ml 血清。 注意： 1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中 保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过 500U时，需将样品稀释。3. 转氨酶只能作用于α－L－氨基酸，对D－氨基酸无 作用。实验室多用α－DL－氨基酸（较L－氨基酸 价廉），若用L－氨基酸，则用量减半。4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高， 会影响测定效果。5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。 6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易 变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不 易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准