兽医病毒学实习九逆转录聚合酵素链锁反应.docVIP

獸醫病毒學實習目的:逆轉錄PCR，或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，RNA鏈被逆轉錄成爲互補DNA，再以此爲模板透過進行PCR複製DNA。 由一條RNA單鏈轉錄爲互補DNA(cDNA)稱作「逆轉錄」，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。隨後DNA的另一鏈通過PCR引子和DNA聚合酶完成，隨每個循環倍增，常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補DNA。RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用於遺傳病的診斷，並且可以用於定量監測某種RNA的含量。 逆轉錄酶是一類存在於部分RNA病毒中具有逆轉錄活性、能以單鏈RNA為模板合成DNA的酶。由逆轉錄酶催化逆轉錄合成的DNA稱為互補DNA（cDNA）。 通常情況下，細胞內的轉錄是以DNA為模板合成RNA的，所得RNA為信使RNA（mRNA）供蛋白質合成作模板用。而在部分RNA病毒中，要實現自身的擴增，必須具有DNA，因此先由RNA逆轉錄合成cDNA再由cDNA轉錄出RNA。 逆轉錄酶可用於RT-PCR，將RNA轉變爲DNA後擴增，以獲得RNA的序列。 逆轉錄酶本身可以從RNA模板轉錄出cDNA，任何的逆轉錄酶包含三個重要生化活性 (1) RNA-dependent DNA polymerase (2) ribonuclease H (3) DNA-dependent DNA polymerase 。這些酵素的活性可以把單股的DNA轉變成雙股的DNA，接著可以插入到宿主細胞的染色體。 一個優良的逆轉錄酶需包含下列三個重要特點: (1)較低的RNaseH活性,因而產生更多的全長cDNA; (2)50時長達220分鐘的半衰期,使得cDNA產量達到最高; (3)50時仍保持全部活性,可提高基因特異性引子的專一性。 。酶包括由human immunodeficiency virus type 1所分離來的HIV-1 reverse transcriptase; 由moloney murine leukemia virus所分離來的 MLV reverse transcriptase; 由avian myeloblastosis virus所分離來的 AMV reverse transcriptase; 由維持真核細胞染色體telomeres所分離來的。 。(二)步驟: Oligo dT primer 1 (l、RNA 3 (l 、dNTP 2 (l 、DEPC 6 (l 所有 13 (l 在 65 作用 5分鐘再放在冰上 2分鐘。 再把所有的13 (l RNA加入 5 x cDNA buffer、4 (l 0.1 M DTT、2 (l Rase out 先在37 作用 2分鐘。 最後再加入1 (l MMLV 於37 作用 50分鐘後再放到70 作用 5分鐘。 (三)補充資料: 逆轉錄聚合酶鏈式反應 逆轉錄PCR，或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成爲互補DNA，再以此爲模板透過PCR進行DNA複製。由一條RNA單鏈轉錄爲互補DNA(cDNA)稱作「逆轉錄」，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。隨後，DNA的另一條鏈通過去氧核苷酸引子和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補DNA。RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用於遺傳病的診斷，並且可以用於定量監測某種RNA的含量。逆轉錄病毒 逆轉錄病毒大小約為100nm (70~110nm，有時至200nm)，外面為一層具有表面突起的脂蛋白封套。封套內有一二十面體的核蛋白衣(nucleo capsid)，核蛋白衣內有一螺旋結構的核糖核蛋白(ribonucleoprotein)，當以負染色電子顯微鏡觀察時，許多反轉錄病毒，尤其是引起動物白血病及腫瘤者，都是多形性病毒顆粒，對滲透壓的改變非常敏感，當樣品處理時常會使病毒破碎。此科的亞科致腫瘤RNA病毒(Oncovirinae)，可於許多細胞內繁殖達到很高的力價而不改變細胞的性狀。尤其是在薄切片時經常可看到直徑為85~110 nm的C顆粒，大部分哺乳動物都有相關的C顆粒。在薄切片時，C顆粒因其核心殼(core shell)及其染色較深的核蛋白衣呈同心狀排列而類似靶心。B型致腫瘤RNA病毒如鼠乳房瘤病毒 (mouse mammary tumor