二氮嗪对深低温脑缺血再灌注大鼠脑组织NR1表达的影响论文.docVIP

　　二氮嗪对深低温脑缺血再灌注大鼠脑组织NR1表达的影响论文 .freela公司）、NR1（Santa Cruz公司），羊抗兔即用型 SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析 系统（江苏捷达）。 1.3 动物模型建立 用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及头部。剃除颈部及腹股沟处鼠毛，碘伏消毒皮肤，酒精脱碘后，纵行剪开颈部皮肤，从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线，用纱布盖好切口;用涂有石蜡油的温度计插入肛门3cm ，探测大鼠的体温（通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温度）。将鼠置冰盒并用冰块袋包埋大鼠行物理降温。当体温降至21℃时停止降温，用动脉夹阻 断两侧颈总动脉，使体温维持在（21±1） ℃，60min 后恢复颈总动脉血流。用电吹风给大鼠复温，每分钟体 温恢复不超过0.5℃，大约在0.5h内将体温恢复到32℃，再将大鼠放入35℃早产儿孵育箱复温，在2h内将体温恢复到37.5 ℃体温，维持正常体温4h后放置室温下正常饲养。 1.4 动物分组 ①假手术组:102只，不夹闭左右颈总动脉，不注 射药物;②模型组:102只，术前腹腔内注射等体积生理盐水;③二氮嗪组:102只，术前腹腔内注射二氮嗪5mg · kg-1。模型组和二氮嗪组再分为缺血60 min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，假手术组分为术后2、6、12 h和1、2、3、7d共7个小组，每个小组 16只，其中6只用于脑组织含水量测定，10只用于石 蜡包埋后行免疫组化检测。 1.5 脑组织含水量测定 待测含水量的脑组织标本测定其湿质量及在电热 恒温干燥箱中100 ℃48h的干质量，以计算含水量。公式如下:含水量=（湿质量-干质量）/湿质量× 100%。 1.6 脑组织中NMDAR1的表达情况 大鼠脑组织予多聚甲醛灌注、固定，完毕后断头取脑，脑组织采用4%多聚甲醛溶液再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。步骤如下:切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内 源性酶，热修复抗原，5%BSA封闭，加入兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗体（1∶100）4℃过夜，再滴加生物素化山羊抗兔IgG室温保存20 min，SABC室温20min，滴加新鲜配置的DAB显色液进行显色，苏木素复染，常规脱水，透明，中性树胶封片后，光镜下观察。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（400×）观察并取其平均值，以灰度值来表示NR1的表达水平，灰度值越高，免疫组织化学染色越浅，NR1表达越低。 1.7 统计学处理 所有实验数据用 x-±s 表示，采用SPSS11.0统计软件进行析因设计资料的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，两两组间均数之间比较采用SNK检验，相同时间点两组间比较用 t 检验，P 0.05表示差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 各组大鼠脑组织含水量 结果见表1。3组脑组织含水量在缺血再灌注后2、6h未见明显区别，再灌注12h、1d时3组之间差异有统计学意义（P 0.01），模型组含水量明显高于二氮嗪组和假手术组，二氮嗪组高于假手术组，2d时模 型组和假手术组之间比较差异有统计学意义（ P 0.01），二氮嗪组和假手术组间差异无统计学意义（P 0.05）。3 d和7d 3组间无统计学差异（P 0.05）。表1 3组大鼠缺血再灌注不同时间脑含水量比较（略） 2.2 脑组织NR1的表达 模型组NR1在2h开始升高，1d达到高峰后下降，7d达到正常水平。二氮嗪组变化与模型组类似，但NR1表达水平低于模型组，假手术组NR1表达水平最低，3组各时间点（除7 d外）均有统计学差异（P 0.05）。3组灰度值见表2（灰度值越高，表明NR1表 达越低）。表2 各组再灌注后NR1的表达情况比较（略） 3 讨 论 ATP依赖性钾通道（KATP）属于内向整流型钾通道，由完全不同的两个亚单位构成，即内向整流亚单 位Kir 61x（Kir611和Kir612）和磺酰脲受体（SUR）两种蛋白质构成［2］。KATP同时存在于细胞膜和线粒体膜上，是一种应激活化分子，缺氧、代谢毒物等均可将其激活，从而调节机体对外界刺激的适应性。其中线 粒体ATP依赖性钾通道（mito KATP）被认为是组织缺血、缺氧保护的共同效应器［1］ 。mito KATP的开放剂能有效地保护缺血再灌注损伤，是减轻缺血损