发酵黄芪对BALB-C小鼠免疫功能及细胞因子的作用论文.docVIP

　　发酵黄芪对BALB/C小鼠免疫功能及细胞因子的作用论文 .freela公司产品。 抗Thy1、2;抗LST4、抗 Lyt2美国FLUKA公司;环磷酰胺，上海第二制药厂制造，(CycloPhosPhamide， CP)。二甲基亚砜(DMSO)购于上海化学试剂公司，其余试剂均为分析纯。 1.3 仪器倒置显微镜(PM-10AD)，OLYMOUS日本。二氧化碳孵箱(TC2323，美国SHEL.LAB公司);酶标仪(奥地利公司)。流式细胞仪，美国(FACS-420)。 2 方法 2.1 动物分组处理与给药BALB/C小鼠随机分成6组，每组7只动物，分别为生理盐水对照组、环磷酰胺组、黄芪对照组、发酵黄芪小剂量组(1 g/kg)、中剂量组(2 g/kg)和高剂量组(5 g/kg)。黄芪组(1 g/kg)每天每只灌服0.5 ml，对照组灌服等量生理盐水。环磷酰胺组ip给药连续3 d造模。第8天各组颈椎脱臼处死小鼠，无菌取胸腺、脾测定。 2.2 脏器/体重比值测定实验结束，称质量、胸腺重、脾重，取小鼠脾脏和胸腺称重(湿重)，计算脏器指数(%)=脏器重量(g)/动物质量(g)×100%。 2.3 小鼠脾细胞悬液的制备及脾淋巴细胞活力的检测采用MTT法3 小鼠分组与喂饲方法同上。 无菌取脾，经过研磨200目细胞筛网过滤、经常规裂解红细胞，hanks液洗涤，离心2次，制得单细胞悬液，最后用含10%小牛血清RPMI-1640调细胞浓度5×106个/ml，接种于96孔板(100 μl/孔)，每组6个平行孔，每孔100 μl。37℃保湿培养68 h后，每孔加MTT 10 μl，继续培养4 h后，每孔加入DMSO 150 μl，振荡5 min，紫色结晶完全溶解后于酶标仪570 nm测定A值。 2.4 小鼠脾细胞亚群测定(流式细胞仪)4将6～8周龄、体质量(20±2) g BALB/C雌性小鼠随机分成6组，每组6只。无菌取小鼠胸腺细胞，4%甲醛固定，预冷PBS清洗，加入荧光标记的CD3、CD4、CD8单克隆抗体50 μl，37 ℃ 30 min， 1 000 r/min离心10 min，加入荧光标记的二抗工作液50 μl，37 ℃ 30 min，RNase消化，1ml碘化丙啶，每份样本平均测定1×104个，分析相应阳性细胞的含量。 2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定5 小鼠分组与喂饲方法同上。按常规制备小鼠腹腔巨噬细胞，置24孔培养板每孔加细胞悬液1 ml，5% CO2，37 ℃ 培养2 h，去上清液，用RPMI 1640培养液洗去未贴壁细胞，每孔加入0.1%中性红生理盐水液1ml，5% CO2，37℃培养2 h后，甩弃中性红，并用预温的BPS清洗未吸收的中性红，吸水纸吸干，每孔加入细胞裂解液1 ml，静置4 ℃ 过夜，用蒸馏水调零，于722分光光度计550 nm处测定吸光度A值，A值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。 2.6 腹腔巨噬细胞产生IL-1的诱生及测定5小鼠分组与喂饲方法同上。将24孔板中贴壁纯化的腹腔巨噬细胞各孔加入LPS(终浓度10 μg/ml)培养24 h后收获上清，为诱生的IL-1粗品，-20 ℃ 保存待测。无菌取C57BL/6小鼠胸腺细胞，用10%小牛血清的RPMI-1640清洗并调细胞浓度1×107个/ml，加入96孔平底板，每孔0.1 ml，同时加入1∶4稀释的诱生IL-1 0.1 ml，ConA(终浓度2.5 μg/ml)0.1 ml，每只鼠3个复孔，置5%CO2，37 ℃ 培养，用MTT比色法测定胸腺细胞的增殖。 2.7 脾细胞IL-2的诱生及测定6小鼠分组与喂饲方法同上。按常规制备脾细胞，调细胞浓度为2.5×106个/ml，置24孔板孔/1ml，加入ConA(终浓度2.5 μg/ml)1 ml/孔，置5% CO2，37 ℃ 培养40 h后，收获上清为诱生的IL-2，-20℃保存待测。常规制备正常小鼠脾细胞，调细胞浓度2.5×106个/ml，加入96孔平底板，每孔0.1 ml，加入1∶8稀释的诱生IL-2 0.1 ml，每只鼠3个复孔，同时加入ConA(终浓度2.5 μg/ml)0.1ml，5 %CO2，37 ℃ 培养，用MTT比色法测定T淋巴细胞的增殖。 2.8 统计学处理实验数据用±s表示，统计分析采用SPSS11.5软件进行F检验和q检验。 3 结果 3.1 发酵黄芪对小鼠脾、胸腺指数的作用由表1可见，黄芪及发酵黄芪与环磷酰胺组相比较对胸腺重量影响不明显，无显著性差异(P 0.05)，但是与环磷酰胺对照组比较可以显著提高脾脏指数，差异有显著性，且有剂量依赖关系，发酵黄芪可显著增加小鼠脾脏指数。表1 发酵黄芪对小鼠脾、胸腺指数的影响(±s)% 3.2 发酵黄芪对淋巴细胞增殖的影响由表 2 可见，发酵