多糖提取的相关操作.docVIP

DEAE柱： 准备柱子： 洗柱：洗涤剂、自来水、去离子水，洗至不挂水珠、水不成股下流。 浸泡滤膜：95%酒精，浸泡柱上下滤膜（包括胶圈）至少30min，时间可延长（5h左右），主要作用是脱去脂溶性杂质。每次柱使用完毕后都要做此步骤。 洗布氏漏斗：用10%HCL 抽滤，后用蒸馏水洗涤，去除滤膜板中可能灰尘。 装柱：铁夹夹紧对齐，装完柱后要检查是否漏水。 准备填料：（再生步骤） DM过酸过碱：0.2M/L HCL 和NaOH 浸泡填料，先碱后酸，从加入碱时开始计时，一般为30min，加入时用玻棒搅动，以防与碱作用不充分。但若是新填料，浸泡20min后即可使用。碱对填料有影响，忌浸泡时间超过30min，一般20min即可。入碱后，用去离子水（﹥2L，充分去除OH根离子）在布氏漏斗上过滤。脱水完全(洗2-3遍至中性)。后浸泡酸。重生方法同上。 脱气：先溶解DM，再倒入抽滤瓶，真空抽滤，至无白沫，可时而摇晃，抽至无白沫无气泡。重要，最好能延长脱气时间。 上柱： 倾倒填料时浓度尽量稀，使填料贴壁下流。静止。待填料沉降，吸出上清液，统一收集，反复此操作，尽可能回收填料。（尽量不起气泡）沉降一段时间后，待上清未完全沉降时倒入尚未倒完的胶，防止多次倾倒引起的分层现象。此时，用夹子夹住软管，使其不漏液，待沉降完全，出现清水层，去除夹子，滴液。 平衡： 若上柱平衡后暂时不上样，可隔一天平衡一次，防止长菌。滴数：三秒1滴，20分钟收集一管约10ml，33小时过柱一体积。水层不能滴干，防止胶出现干裂现象。 检验： 用1M AgNO3 检验过柱水中Cl离子是否洗净，至无Cl离子后再过一柱体积。皆用去离子水。 上样： 上样前样品水溶，离心，先取上清，收集保留不溶物。 粗柱子：DEAE量占柱体积80%高度（标记高度，要有足够的塔板数），上8克样。上样步骤：先将螺旋拧开，用夹子夹紧软管，放在液面以上，使其液面不下降。取出上层流动相，使液面与填料面相切，用移液管加样，加样使尽量靠近填料，贴着柱子壁转一圈，均匀加样。加完后用流动相洗一下残留在壁上的样品。松开夹子，使其滴液，待样品吸附上填料后，夹紧夹子，放在液面以上，在柱子内加入一段流动相，拧上螺旋，开始走样。 流速：六秒一滴。 流动相：视多糖的实际情况而定。 硫酸苯酚法测多糖： 先确定样品出现的管数，确定头和尾后，三管一测。 方法：100微升样品，400微升5%苯酚(枪头)，2ml浓硫酸(移液管)。振荡后静置1小时。490nm处测量。 试剂的配置：苯酚沸水浴溶解，制备5%溶液500ml备用。 收集： 旋蒸： 收集到一定量后，进行旋蒸，浓缩至10ml内。 透析： 透析袋的准备：剪20cm左右透析袋，烧杯中沸煮5分钟后用蒸馏水60℃冲洗2分钟，4℃待用。使用后用蒸馏水或者加0.05%-0.1%的叠氮钠的蒸馏水保存，每次使用之前都用水清洗、沸煮。（非即用型） 透析袋的选择：一般根据所得的糖的分子大小来选择透析袋，在未知的情况下使用孔径最小的透析袋（截留分子量3000）。 透析：加样至透析袋的2/3，两头用夹子夹住，纯水透析，一小时换一次水，4至5次。过夜。 11、再次浓缩至高度少于1cm，冻干。 二、G100柱： 1、G100的准备： （1） 先确定装柱的体积，再确定装柱的质量，具体换算公式为：1克凝胶吸水10ml*10倍即100（G100型号判定）。 （2） 将胶泡在将胶泡在超纯水，3天，多放点水，要换水去杂质。（新胶） （3） 脱气。 2、装柱： （1） 将胶混匀装柱，不可起泡，倒入装柱，玻棒引流。最好是边轻轻搅动边倒胶。 （2） 沉降，接恒流泵，平衡流速极慢。平衡至胶的高度不变。 3、流速：上样后流速50分钟6ml。 4、流动相：万分之一的NaN3，其他视实验要求而定。 5、当柱子压力变大，流速自动变慢后，可倒流冲洗，流速可快一点。 6、上样： 110mg左右，溶至1ml，震荡漩涡器充分溶解，上样之前过滤。上样时，取出胶面上层的清夜，将样品贴在柱子内侧成圈状加样，越靠近胶面越好，残留在柱子上的样品越少越好。少量流动相清洗柱子壁。待样品都吸附在胶上，加上上清流动相，开始走样。 7、检测方法： 50ul样+1ml 5%苯酚（配制苯酚时，所有容器预热）+2ml浓硫酸，室温后测量。490nm。收集到一定量后，浓缩至10ml以内。 8、透析： 加样至透析袋的2/3，纯水透析，一小时换一次水，4至5次。过夜。用最小截留分子量的透析袋。 透析袋分即用型和非即用型，即用型用蒸馏水冲洗后直接使用，无需前处理。非即用根据说明书进行前处理，比较常见的处理方法为：用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分