任务单元抗原抗体的制备.ppt

原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。 主要步骤 破碎细胞 蛋白质的去除 核酸的沉淀 酚和氯仿 乙醇 核酸的保存 （1）温度 -70℃ 长期保存 -20℃ 4℃（5℃）最佳和最简单 （2）介质 TE缓冲液（最常用） （1）非共价键解离法 肽链亚单位之间以氢键、静电引力等非共价键结合，这些键结合力较弱，可经2种方法将其断开制备片段。 ①改变pH：蛋白质解离的临界值为pH 3～4(羧基滴定范围)和pH 9～10(赖氨酸—酪氨酸滴定范围)，当加入酸或碱使pH低于，3或高于10时，肽链亚单位就会解离； ②利用强变性剂：多数蛋白在8mol／L脲或6moI儿盐酸胍中会发生变性，使肽链亚单位解离，此法也可用于载脂蛋白抗原的解离和胶原肽的提取。 （2）共价键解离法 二硫键是连接免疫球蛋白肽链的共价键，解离二硫键可将轻链与重链分开。解离的方法多采用氧化法和还原法。氧化法的优点是切开二硫键后，肽链不能重新形成二硫键，便于肽链纯化，缺点是蛋氨酸(甲硫氨酸)被氧化成亚砜，色氨酸侧链被破坏。 还原法目前常用，其原理是将二硫键还原成巯基，但还原的琉基极不稳定，易再重新结合成二硫键，必须及时用碘乙酸或碘代乙酰胺进行羧甲基化以封闭巯基。 （3）酶解法 酶解法的专一性极好，不同的片段可用不同的酶进行裂解。如木瓜酶水解IgG可获得1个Fc段和2个Fab段；胃蛋白酶水解IgG可获得F(ab)：和数个小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作为抗原来制备抗重链血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab)；常作为抗体试剂应用。 1.定量测定 生化技术 如 UV法、双缩脲、酚试剂等蛋白检测方法。常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm和260nm的吸光度(A)值，并根据公式计算蛋白含量。 蛋白含量(mg／m1)＝A280nm×1.45-A260nm×0.74 2.纯度鉴定 PAGE、免疫电泳、双扩 3.免疫活性鉴定 免疫电泳、双向免疫扩散法、ELISA 4.浓缩与保存 半抗原：仅有抗原性的物质。 半抗原+载体=完全抗原 （一）载体 1.蛋白质 是结构复杂的大分子胶体物质，是一种良好的载体，常用的有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。其中牛血清白蛋白溶解度较高、免疫原性强且易获得，因此最为常用。蛋白质与半抗原的结合主要通过游离氨基、游离羧基、酚基、巯基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基团的缩合。 2.多肽聚合物 人工合成的载体。常用多聚赖氨酸(polylysine)，其分子量高达lOOkD以上，是良好的载体。这种多肽聚合物与半抗原结合后，可诱导产生高效价、高亲合力的抗体。 3.大分子聚合物 羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonc，PVP)等大分子聚合物均可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。 （二）半抗原与载体的连接方法 1.物理法 通过吸附作用。 2.化学法 通过交联实现。 （三）半抗原的鉴定 1.目的：测定半抗原与载体的比例。 2.测定方法： （1）吸收光谱分析法 （2）放射性核素标记半抗原掺入法 （1）如果半抗原有适宜的吸收光谱，测定在一定波长下复合抗原和载体之间克分子吸光度的差别，然后把这个差别与同样波长下半抗原的克分子吸光度数相比较，就可以准确地计算出所结合的半抗原分子数。 （2）在偶联反应液中加入一定量的放射性核素标记的半抗原，偶联反应后经充分透析，测量透析袋中的放射性含量，计算结合到载体上的半抗原分子数。 免疫佐剂（佐剂）：先于抗原或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质被称为免疫佐剂，简称佐剂。 本质：佐剂可视为一种非特异性免疫增强剂，可增强体液免疫和细胞免疫应答。 1.种类 具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。 不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。 应用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。 （1）福氏佐剂：分完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗）、不完全福氏佐剂（石