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凝胶柱层析分离牛血清蛋白 一、层析的分类 （一）按操作方式分类 层析的分类 柱层析 （column chromatography） 将固定相装在层析柱中，使样品朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。 凝胶层析 (分子筛过滤、排阻层析) 混合物随流动相经固定相(网状孔径)的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。 固定相（凝胶） 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致。 二、凝胶层析的原理 比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，首先流出。 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内部，然后再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出。 即牛血清白蛋白（BSA），牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。 白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。 牛血清的主要成分 　　牛血清是一种成分复杂的混合物，其大部分成分已为人所知，但还有一部分仍不清楚，而且血清的组成及含量通常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而存在差异。牛血清主要成分有以下几类： 1、蛋白质类 包括白蛋白、球蛋白、α-巨球蛋白（抑制胰蛋白酶的作用）、胎球蛋白（促进细胞附着）、 转铁蛋白（能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用）、纤维粘连素（促进细胞附着生长）等； 2、多肽类 主要是一些促进细胞生长和分裂的生长因子，最主要的生长因子是血小板生长因子，还有成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，虽然在血清中含量很少，但对细胞的生长和分裂也起着重要作用； 3、激素类 激素对细胞的作用是多方面的。包括： 胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关； 类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用： 促生长激素：促进细胞增殖的效应； 氢化可的松：血清中含有微量该成分，它可能具有促细胞贴附和增殖作用。但有人证明，血清中 的氢化可的松，在细胞密度较高时可能有抑制细胞生长和诱导细胞发生分化的作用。 4、其他成分 如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。在合成培养基中这些成分的作用并不明显，与蛋白相结合的微量元素对细胞生长起促进作用。 四、预处理 取离心管一支加入牛血清2ml，加入等量PBS（磷酸盐缓冲液生理盐水）稀释血清，摇匀后逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml，边加边摇，然后静止放置10min，再4000r／min离心10min，将上清液倒入试管中。 五、实验步骤 实验步骤 （一）凝胶的准备 1. 将Sephadex G-75置烧杯中，加入洗脱剂，搅拌均匀，在室温溶胀6h，或沸水浴溶胀 2h，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用洗脱剂反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。 2. 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是以干品出售的，所以在使用前必须溶胀。洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。这是因为大多数凝胶都含有少量羧基，如果洗脱剂的离子强度低于0.08，少量羧基不能被屏蔽，凝胶颗粒就具有离子交换性质，从而改变溶质的分配系数。溶胀时搅拌可能产生很细的颗粒，必须将其除去，否则会严重降低柱的流速。琼脂糖凝胶是以浓的悬浮液形式出售的，不需溶胀。 （二）装柱 将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱剂，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约2cm高度的洗脱剂，拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过1cm时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8cm,关闭出口。 装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡1至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。 （三）加样与洗脱 1. 加样时先将柱的出口打开，让洗脱剂逐渐流出，待凝胶床面与液面刚好平齐时，关闭出口（注意：不可使凝胶柱表面干涸）