分离科学灌注色谱.pptVIP

* * 灌注色谱法 凝胶色谱在分离生物大分子中的地位十分重要，但是存在凝胶孔内流动相停滞区域传质阻力，分离度低。尽管通过减小介质粒度和改进介质制备方法可减小这种影响，但无法完全消除。因此，开发用于高效、快速分离生物大分子的色谱介质，受到重点关注。 灌注色谱法就是采用大孔填料，在高流速下产生溶质随流动相穿透填料粒子的传质方式的新型色谱技术。 灌注色谱的提出 （1）早期有很多研究人员提出了在不断增加压降的条件下加快传质过程的设想，其中最具有代表性的学者是Gibbs等，当时他们的研究仅局限于凝胶渗透色谱法。 后来，Van Kreveld等报道了用凝胶色谱法分离大分子化合物（分子量为160 000的聚苯乙烯标准品）的理论板高在线速度高于1cm/s的条件下，不随线速度而变。他们把这一实验结果归结为对流速度的增加引起液流贯穿介质的缘故。 （2）在研制用于过滤或作为催化剂载体的膜和大孔聚合物颗粒（孔径达到100～1000nm）时发现，当膜的孔径达到0.5um时，只要两边有微小的压力差，便可引发孔内的对流传质。 如果在色谱填料颗粒上有这种横穿粒子的特大的对流传质孔，被分流溶质便会随流动相一道迅速接近介质的内孔表面，而不是靠浓度梯度进行扩散传质，因而能加快传质过程。 （3）英国的PL实验室生产并销售粒径为8～10?m的苯乙烯-二乙烯基苯共聚树脂介质，按平均孔径可分为两种类型：100nm和400nm快速大孔树脂。实验证明，在第一种粒子中，穿透孔的平均直径超过200nm；而在第二种粒子中，穿透孔的平均直径超过600nm。在适当的高流速下能产生溶质随流动相穿透粒子的传质方式。实际上，这种以对流传质为特征的过程与肾脏和其他器官的灌注过程十分相似，基于这一原理，Afeyan等人于1989年申请了这种聚合物色谱介质的美国专利，并把这种分离过程称为灌注色谱（Perfusion Chromatography）。 灌注色谱法的基本特征 美国Perseptive Biosystems公司开发的POROS系列灌注色谱填料是由苯乙烯和二乙烯基苯通过悬浮聚合、乳液聚合等方式制备的多孔型高分子微球，其颗粒内部分布着两种结构的孔隙。 随着连接的官能团不同，又分为反相（R型）、强阴离子交换（Q型）和强阳离子交换（S型）等多种模式的介质类型。 介质本身的孔隙率约为50％，一般可耐压20MPa。 一种是贯穿整个颗粒的特大孔，孔径在600-800nm之间，称为穿透孔或对流孔； 另一种是连接这些特大孔的较小一些的大孔，孔径为50～150nm。孔深一般不超过1um，被称为连接孔或扩散孔。 这种介质的一个突出特点是孔内“停滞流动相的传滞阻力”大大减小。这是因为颗粒内的传质过程主要靠穿透孔内的对流传递，生物大分子溶质能随流动相的液流迅速达到孔内的活性表面。 虽然在穿透孔之间还存在若干扩散孔，它们不能形成快速对流传质，但这种孔的深度一般不超过1?m，扩散程很短，不会造成明显的传质阻力，而且扩散孔的存在恰恰提供了较大的表面积和柱容量。 灌注色谱法利用流动相和溶质的对流作用，降低了溶质在介质内滞留的限制，明显地缩短了蛋白质的分离时间，无论是分析色谱还是制备色谱，进行时得到的蛋白质质量、产量和产率都有所提高。根据这种色谱的特殊结构，在高流速下也不会因传质来不及而使谱带展宽。 在柱容量方面，灌注色谱介质因扩散孔的存在，其结合和分离蛋白质的量与一般HPLC大孔介质相当。灌注色谱的柱容量很少受流速的影响，因而用该法分离和纯化蛋白质能得到更高的产率。 灌注色谱法的原理 折合板高h是间接评价分离介质性能的参数之一，它受多种因素影响，通常可表示为： h＝Av1/2 + B/v + Cv （1） 式中，v是通过柱床的流体折合流速，A是涡流扩散系数，B是纵向分子扩散扩散系数，C表示停滞流动相传质阻力系数。 在高流速下，谱带展宽主要由C控制。此时式（1）可表示为： 这里u为流动相的线速度，Deff为有效扩散系数，dp为担体微粒的直径，c为系数。 公式（2）表明，对于一般HPLC，流速越快，折合板高就越大，分离度就越低。 （2） 灌注色谱当流速增加到一定程度时，介质的穿透孔内对流速度会超过扩散速度，Deff可近似认为由对流因素来决定: Deff = upore?dp 对于给定的色谱柱和流速，穿透孔中的流速与床内流速的比值为常数： upore/u=k Deff =k ? u ? dp 由此得 h=