GUS酶活性测定.pptxVIP

荧光分析法测定植物体内GUS酶活性 反应原理 4-MUG (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide) (C16H16O9 ), 4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷) 分子量：352.3， CAS：6160-80-1 4-MU(4-methylumbelliferone), 4-甲基伞型酮, 分子量：176.2， CAS号：90-33-5 GUS酶活性 （pmol 4-MU/hr/ug protein) 反应底物（4-MU）的物质的量 反应时间*蛋白含量 注： 4-MU的浓度是由荧光分光光度计测得数值后从标准曲线上读数获得； 反应时间可以设置梯度时间：5min、10min、20min、30min、45min和60min等, 也可以只取一个时间； 蛋白浓度是通过考马斯亮蓝法测得吸光度后从BSA标准曲线读数获得。 反应底物（4-MU）的浓度*（体积） 反应时间*蛋白浓度*（体积） 测定原理 GUS酶提取 取植物样品（叶、根）20mg于预冷的1.5mL eppendorf管中，加入液氮研磨成粉末，加入200uL的提取buffer，混匀； 13000rpm, 4℃离心15min，吸取上清于另一eppendorf管中4℃备用。可以做几个平行。 MU标准曲线的制作 用反应终止液将MU母液（1mM）稀释成浓度范围在0－10uM的系列标准液，通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。 具体步骤： 配置4-MU 1mM的母液，称取0.04404gMU用stop solution定容到250ml; 配制4-MU梯度浓度液(由反应终止液配制)； 在激发光365nm，发射光455nm,狭缝3nm条件下，测定各样品的荧光值，绘制标准曲线。 实验注意事项： 4-MU梯度浓度液的配置时需要根据预估样品的浓度范围来确定，要求是4-MU的浓度梯度要跨过样品的浓度范围。 预估时可以参考一下数据： 0.05nmol的MU的荧光强度是843; 0.1nmol是1968; 1.5nmol是56247 蛋白标准曲线的制作 BSA母液（100ug/ml）,分别吸取:0ul, 10ul, 20ul, 30ul, 40ul, 50ul, 60ul, 70ul, 80ul, 90ul, 100ul,150ul, 200ul, 300ul, 400ul.用水补到1ml,加入3ml的G250.反应半小时后比色.(BSA的质量分别为0 ug,1 ug ,2 ug ,…….15 ug,20 ug ,30 ug ,40ug) 以吸光度-蛋白含量做标准曲线图。 样品GUS酶活性测定 样品蛋白含量的测定：取出提取的上清液20ul加双蒸水定到1ml,加入3毫升的G250 室温反应至少5min,但是不要超过1h,一般是半个小时后,用分光光度计来测定吸光度 (595nm)后从标准曲线上读数； 设定时间内的4-MU浓度测定：取10ul蛋白上清，加入390ul反应缓冲液里(37℃预热)，立即取100ul加入到900ul反应终止液(0时的空白对照)，37℃温浴，严格定时，10min, 30min和60min各取100ul，加入900ul反应终止液。测定荧光值。根据标准曲线，计算各样品产物浓度； 最后根据公式算出酶活性。 实验中涉及到的溶液的配置 1、Extraction buffer : 0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0） 50ml 10% SDS 1ml 0.5M EDTA(PH8.0) 2ml Triton X-100 100ul β-巯基乙醇 100ul ddH2O up to 100ml 2、GUS assay buffer : 称取22mg 4-MUG于50ml的GUS extraction buffer中，4℃保存。 3、Stop solution: 0.2M Na2CO3 4、G-250 dye: coomassie blue G250 20mg 95% 乙醇 10ml 磷酸 20ml ddH2O up to 200ml 实验结束后清洗工作: 96孔板用过以后用清水洗净,然后用碱液(氢氧化钠溶液)浸泡一个小时后用清水洗净后烘干后备用. 测蛋白的比色杯用酒精洗净后用清水洗净,烘干后备用.